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Express GamS 核酸酶抑制剂 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEBExpress GamS 核酸酶抑制剂是一种重组蛋白，可以抑制核酸外切酶 V（RecBCD）的活性，并在基于大肠杆菌的体外蛋白合成反应中稳定线性 DNA 模板。

图 1：利用 NEBExpress® 无细胞 E. coli 蛋白合成系统和 NEBExpress GamS 核酸酶抑制剂进行线性 DNA 模板蛋白合成

Express GamS 核酸酶抑制剂 |

50 µl 反应体系，含 100 ng 线性 DNA 模板、NEBExpress® 无细胞 E. coli 蛋白合成系统组份和 1.5 µg NEBExpress GamS 核酸酶抑制剂，37℃ 温育 5 小时，通过荧光信号检测活性。

产品来源

克隆自 lambda 噬菌体，在大肠杆菌中表达。
 

产品类别:
NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System,
Cell-Free Protein Expression,
Protein Expression

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • P0774S     -20    
        NEBExpress® GamS Nuclease Inhibitor P0774SVIAL -20 1 x 75 µg 1.5 mg/ml

  • 特性和用法

    贮存溶液

    50 mM Tris-acetate
    pH 8.2

  • 优势和特性

    Features

    • 使用 NEBExpress 无细胞 E. coli 蛋白合成系统时提高线性 DNA 合成产量
    • 未检测到蛋白酶活性，确保所需目的蛋白的稳定性
    • 兼容多种目的蛋白，范围从 17 到 230 kDa
    • 灵活的反应条件可实现最大产量：活性可在 37℃ 下持续 10 小时，或在更低的温度下持续 24 小时
     

    应用特性

    • 线性 DNA 表达
    • 困难目的蛋白的表达
    • 高通量实验流程中的蛋白表达

  • 相关产品

    相关产品

    • NEBExpress® 无细胞 E. coli 蛋白合成系统
    • PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒
    • PURExpress® 二硫键增强剂
    • PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒
    • PURExpress® Δ RF123 试剂盒

  • 注意事项

    1. NEBExpress 无细胞 E. coli 蛋白合成系统与线性 DNA 模板兼容。为达到与质粒 DNA 模板相当的表达水平，应在 50 µL 含 250 ng 模板 DNA 的反应体系中加入 1.5 µg NEBExpress GamS 核酸酶抑制剂。
    2. NEBExpress 无细胞 E. coli 蛋白合成系统的详细产品说明书和操作说明可在此处查询。
    3. 常规温育温度为 37℃。降低温育温度能促进某些目的蛋白的折叠。该反应可在 16℃ 至 42℃ 的温度下温育，蛋白合成可在 37℃ 下持续 10 小时，或在更低的温度下持续 24 小时，具体取决于 DNA 起始量和通风情况。
    4. NEBExpress 蛋白合成反应可以按比例放大；包括 GamS 在内的所有反应组份都必须按比例缩放。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Typical Protocol for NEBExpress® GamS Nuclease Inhibitor when used with the NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System (NEB #E5360)

  • 应用实例

    • NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System
    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How does NEBExpress® GamS Nuclease Inhibitor enhance protein yield?
    2. How much linear DNA template and NEBExpress® GamS Nuclease Inhibitor should I add to my reaction?
    3. Is more NEBExpress® GamS Nuclease Inhibitor always better?
    4. Can I freeze-thaw NEBExpress®GamS Nuclease Inhibitor?
    5. How should I prepare my linear DNA?

EnGen Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

EnGen® Lba Cas12a 核酸酶来自毛螺菌科细菌 ND2006（Lachnospiraceae bacterium ND2006），是一种位点特异性 DNA 核酸内切酶，由长度为 41-44 个核苷酸的单向导 RNA（gRNA）介导识别（1）。靶向识别需要一段与目标位点互补的 gRNA，以及位于目标序列对侧的 DNA 链上的 5’ TTTV PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。EnGen Lba Cas12a 核酸酶的切割位点位于 PAM 序列 3´ 端约第 18 个碱基处，切割产物为 5´ 突出末端。EnGen Lba Cas12a 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

 

Lba Cas12a 核酸酶序列识别与切割 DNA 示意图

EnGen Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶 |

Lba Cas12a 核酸酶的活性温度范围更宽

EnGen Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶 |

将纯化的 Lba 或 Asp Cas12a 蛋白与其标准向导 RNA 形成 RNP 复合物。目标 DNA 序列是 5´ 端标记 FAM 的单一 PCR 产物。在所示温度下，将 Lba 或 Asp Cas12a RNP 与目标 DNA 按 10:1 的比例温育 10 分钟。切割产物通过毛细管电泳分离，并通过整合完整片段和切割后片段产生的信号进行定量检测。所示数据为重复实验的平均值 +/- SD。

产品来源

EnGen Lba Cas12a 核酸酶，克隆自毛螺菌科细菌 ND2006（Lachnospiraceae bacterium ND2006），在大肠杆菌中表达，为 N 端含 6xHis 标签的融合蛋白。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0653S     -20    
        EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) M0653SVIAL -20 1 x 0.07 ml 1 µM
        NEBuffer™ r2.1 B6002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0653T     -20    
        EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) M0653TVIAL -20 1 x 0.02 ml 100 µM
        EnGen Lba Cas12a Diluent B0653AVIAL -20 2 x 1 ml 1 X
        NEBuffer™ r2.1 B6002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r2.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r2.1
    50 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    500 mM NaCl
    20 mM sodium acetate
    0.1 mM EDTA
    0.1 mM TCEP
    50% Glycerol
    pH 6 @ 25°C

    热失活

    65°C for 10 minutes

  • 注意事项

    1. 100 µM 等于 15.1 mg/ml EnGen Lba Cas12a 核酸酶。

  • 参考文献

    1. Zetsche, B., et. al. (2015). Cell. 163, 759-771.
    2. Moreno-Mateos, M.A., et al. (2017). Nat. Commun.. 8, 2024. PubMedID: 29222508

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Electroporation of Cas12a Ribonucleoprotein (RNP) into adherent cells using the Neon® Electroporation
    2. Protocol for Electroporation of Cas12a Ribonucleoprotein (RNP) into adherent cells using the Lonza 4D-Nucleofector®
    3. In vitro digestion of DNA with EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (M0653)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What are the differences between EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (NEB #M0653) and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)?
    3. Why am I observing limited or no digestion with EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)?
    4. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    5. Can mutations generated with EnGen Lba Cas12a (Cpf1) be detected using T7 Endonuclease I (NEB #M0302) or the EnGen Mutation Detection Kit (NEB #E3321S)?
    6. Can gRNA for use with EnGen Lba Cas12a (Cpf1) be generated using the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes (NEB #E3322)?
    7. How do I design a guide RNA for use with EnGen Lba Cas12a?
    8. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    9. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?
    10. What is in EnGen Lba Cas12a Diluent (NEB #B0653A)?

EnGen® Sau Cas9 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen® Sau Cas9 核酸酶来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），是一种 RNA 介导的 DNA 核酸内切酶，可催化双链 DNA 的位点特异性切割。靶向目标序列需要一段与目标序列互补的长度约为 100 个核苷酸的向导 RNA（gRNA），同时需要在靶标序列对侧的 DNA 链上存在 5´-NNGRRT-3´（N = 任意，R = A 或 G）PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。EnGen Sau Cas9 核酸酶的 DNA 切割位点位于 PAM 序列 5´ 端约第 3 个碱基处。EnGen Sau Cas9 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猿猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

Sau Cas9 核酸酶序列识别与 DNA 切割示意图

EnGen® Sau Cas9 核酸酶 |

产品来源

EnGen® Sau Cas9 核酸酶来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），在大肠杆菌中表达，为 C 端含 6xHis 标签的融合蛋白。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0654T     -20    
        EnGen® Sau Cas9 M0654TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    20 mM Tris-HCl
    300 mM NaCl
    0.1 mM TCEP
    50% Glycerol
    pH 7.5 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 µM 约等于 2.54 mg/ml EnGen® Sau Cas9 核酸酶，1 µM 等于 0.127 mg/ml。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. How to synthesize a sequence-specific sgRNA for experiments using EnGen® Sau Cas9

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How can the genome editing efficiency be determined following EnGen® Sau Cas9 (NEB #M0654) transfections or microinjections?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Sau Cas9?
    3. Can the EnGen® sgRNA Synthesis Kit (NEB #E3322S) be used to synthesize sgRNAs specific for Sau Cas9?
    4. What is the sequence for a typical guide RNA specific for EnGen® Sau Cas9?
    5. How can I synthesize a sequence-specific sgRNA for experiments using EnGen® Sau Cas9?
    6. Why do I observe incomplete digestion with EnGen® Sau Cas9 and my target-specific Sau sgRNA in vitro?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?

EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen SpRY Cas9 核酸酶来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），是一种经改造的、RNA 介导的 DNA 内切酶，可催化双链 DNA（dsDNA）的位点特异性切割。靶向需要约 100 个核苷酸的单链向导 RNA（sgRNA），与双链 DNA 底物上 PAM（Protospacer Adjacent Motif）上游的 20 nt 区域互补。EnGen SpRY Cas9 编码 11 个点突变（A61R、L1111R、D1135L、S1136W、G1218K、E1219Q、N1317R、A1322R、R1333P、R1335Q、T1337R），旨在降低对 PAM 的要求。与野生型 Spy Cas9 的经典 5´-NGG-3´ PAM 不同，SpRY Cas9 经证明在体外几乎没有 PAM 序列要求，能在许多具有 5´-NNN-3´ PAM 的位点上进行切割（尽管在体内与 5´-NYN-3´ PAM 相比，它表现出对 5´-NRN-3´ 的偏好）（1,2）。EnGen SpRY Cas9 核酸酶进行的 DNA 切割会在 PAM 上游 3 nt 处产生双链断裂。EnGen SpRY Cas9 核酸酶蛋白的 C 端含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

图 1：EnGen SpRY Cas9 核酸酶在体外对双链 DNA 靶向切割没有序列限制

EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |

EnGen SpRY Cas9 是来自化酿脓链球菌的 Cas9 核酸酶的变体，在 PAM 作用结构域内有多个点突变（1）。与野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在体外应用中，可以在任何三核苷酸序列上游 3 nt 处产生双链断裂。

图 2：使用 EnGen SpRY Cas9 核酸酶和 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液可以简化大载体克隆实验流程


EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |

EnGen® SpRY Cas9 切割灵活性演示。A) 标有限制性内切酶 BsrGI 识别位点的 pXba 示意图。矩形框中显示了 BsrGI 识别序列，其切割位点用红色三角形表示。B) 用于靶向 pXba 中 BsrGI 位点的三种 sgRNA 序列。EnGen SpRY Cas9 和 BsrGI 的切割位点均用红色三角形表示。SpRY Cas9 非经典 PAM 以黄色文本表示。C) 在 1X NEBuffer r3.1 中，用 10 个单位的 BsrGI 或 1 µM EnGen SpRY Cas9 以及靶向 pXba 中所有三个 BsrGI 位点的三种 sgRNA 各 1 µM 消化 1 µg pXba（22,563 bp）。所有反应体系先在 37℃ 下温育 1 小时，然后再在 80℃ 下温育 5 分钟。使用 Agilent gDNA ScreenTape 系统，在 4200 TapeStation 仪器上通过凝胶电泳比较 BsrGI 和 SpRY 消化后产物 DNA 条带。BsrGI 和靶向 BsrGI 位点的 SpRY Cas9 对 pXba 的切割产生了几乎相同的条带图谱。使用浓度低至 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 sgRNA 消化 1 µg pXba 产生的切割与使用 1 µM 的结果相似。未消化的 pXba 作为对照进行电泳，但环状 DNA 在 gDNA ScreenTape 系统中不能精确的按照大小进行分离。垂直灰线标记了两个不同 ScreenTapes 的使用位置。

图 3：使用 EnGen SpRY Cas9 对 22.6 kb 质粒进行线性化，然后使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液进行克隆。


EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |

确定 EnGen SpRY Cas9 核酸酶消化产物是否适用于后续的 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液反应。A) 线性化和克隆方案的示意图。在 1X NEBuffer r3.1 中，使用 50 nM EnGen SpRY Cas9 和 50 nM sgRNA（靶向序列 5´-CTTTTTGAGCAAACATGTCC-3´），在 37℃ 条件下反应 1 小时，将 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII orf 起始密码子的下游进行线性化。在继续进行 DNA 组装之前，线性化质粒可以选择经过离心柱纯化或不纯化。根据推荐的操作说明，使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液试剂盒，将编码核定位序列（NLS）标签的寡核苷酸插入 pVII 中。B) 使用 Agilent gDNA ScreenTape 系统检查 EnGen SpRY Cas9 核酸酶消化后的线性化 pXba（纯化和未纯化的）。未消化的 pXba 作为对照进行电泳，但环状 DNA 在 gDNA ScreenTape 系统中不能精确的按照大小进行分离。C) 使用纯化或未纯化的 EnGen SpRY Cas9 消化产物进行 DNA 组装反应，统计转化后长出的克隆数。包括无插入片段对照，以定性评估 EnGen SpRY Cas9 未消化的质粒产生了多少转化子。在 DNA 组装反应之前，对线性化 pXba 的纯化降低了背景菌落的百分比。从纯化和未纯化 EnGen SpRY Cas9 消化产物中挑选 8 – 9 个转化子菌落，使用跨越插入片段的引物进行 PCR，以检查 DNA 组装是否正确。纯化和未纯化的 EnGen SpRY Cas9 消化产物，其产生的克隆 100% 显示正确的序列插入（数据在此未显示）。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 基因，在其编码蛋白的 C 端含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS），C 端同时带有 6xHis 标签

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0669T     -20    
        EnGen® SpRY Cas9 M0669TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0669M     -20    
        EnGen® SpRY Cas9 M0669MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 µM 等于 3.25 mg/ml

  • 参考文献

    1. Walton, et al. (2020). Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. Apr 17;368(6488), 290-6. DOI: 10.1126/science.aba8853
    2. Christie, et al. (2023). Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat. Biotechnol.. Mar 41, 409-16. DOI: 10.1038/s41587-022-01492-y

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of plasmid DNA with EnGen SpRY Cas9 (NEB #M0669)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Why is it called EnGen SpRY Cas9?
    2. What is the difference between EnGen SpRY Cas9, EnGen Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    3. How do I design a single guide RNA for use with EnGen SpRY Cas9?
    4. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    5. Why do I observe incomplete digestion/editing?
    6. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    7.  Is it necessary to clean up my reaction before using the digestion products with NEBuilder?
    8. Where is the nuclear localization signal on EnGen SpRY Cas9 located?
    9. Which nuclear localization signal is fused to EnGen SpRY Cas9?
    10. Does NEB provide plasmids for guide RNA cloning?
    11. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?