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EnGen Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

EnGen® Lba Cas12a 核酸酶来自毛螺菌科细菌 ND2006（Lachnospiraceae bacterium ND2006），是一种位点特异性 DNA 核酸内切酶，由长度为 41-44 个核苷酸的单向导 RNA（gRNA）介导识别（1）。靶向识别需要一段与目标位点互补的 gRNA，以及位于目标序列对侧的 DNA 链上的 5’ TTTV PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。EnGen Lba Cas12a 核酸酶的切割位点位于 PAM 序列 3´ 端约第 18 个碱基处，切割产物为 5´ 突出末端。EnGen Lba Cas12a 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

 

Lba Cas12a 核酸酶序列识别与切割 DNA 示意图

EnGen Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶 |

Lba Cas12a 核酸酶的活性温度范围更宽

EnGen Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶 |

将纯化的 Lba 或 Asp Cas12a 蛋白与其标准向导 RNA 形成 RNP 复合物。目标 DNA 序列是 5´ 端标记 FAM 的单一 PCR 产物。在所示温度下，将 Lba 或 Asp Cas12a RNP 与目标 DNA 按 10:1 的比例温育 10 分钟。切割产物通过毛细管电泳分离，并通过整合完整片段和切割后片段产生的信号进行定量检测。所示数据为重复实验的平均值 +/- SD。

产品来源

EnGen Lba Cas12a 核酸酶，克隆自毛螺菌科细菌 ND2006（Lachnospiraceae bacterium ND2006），在大肠杆菌中表达，为 N 端含 6xHis 标签的融合蛋白。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0653S     -20    
        EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) M0653SVIAL -20 1 x 0.07 ml 1 µM
        NEBuffer™ r2.1 B6002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0653T     -20    
        EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) M0653TVIAL -20 1 x 0.02 ml 100 µM
        EnGen Lba Cas12a Diluent B0653AVIAL -20 2 x 1 ml 1 X
        NEBuffer™ r2.1 B6002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r2.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r2.1
    50 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    500 mM NaCl
    20 mM sodium acetate
    0.1 mM EDTA
    0.1 mM TCEP
    50% Glycerol
    pH 6 @ 25°C

    热失活

    65°C for 10 minutes

  • 注意事项

    1. 100 µM 等于 15.1 mg/ml EnGen Lba Cas12a 核酸酶。

  • 参考文献

    1. Zetsche, B., et. al. (2015). Cell. 163, 759-771.
    2. Moreno-Mateos, M.A., et al. (2017). Nat. Commun.. 8, 2024. PubMedID: 29222508

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Electroporation of Cas12a Ribonucleoprotein (RNP) into adherent cells using the Neon® Electroporation
    2. Protocol for Electroporation of Cas12a Ribonucleoprotein (RNP) into adherent cells using the Lonza 4D-Nucleofector®
    3. In vitro digestion of DNA with EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (M0653)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What are the differences between EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (NEB #M0653) and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)?
    3. Why am I observing limited or no digestion with EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)?
    4. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    5. Can mutations generated with EnGen Lba Cas12a (Cpf1) be detected using T7 Endonuclease I (NEB #M0302) or the EnGen Mutation Detection Kit (NEB #E3321S)?
    6. Can gRNA for use with EnGen Lba Cas12a (Cpf1) be generated using the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes (NEB #E3322)?
    7. How do I design a guide RNA for use with EnGen Lba Cas12a?
    8. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    9. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?
    10. What is in EnGen Lba Cas12a Diluent (NEB #B0653A)?

EnGen® Sau Cas9 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen® Sau Cas9 核酸酶来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），是一种 RNA 介导的 DNA 核酸内切酶，可催化双链 DNA 的位点特异性切割。靶向目标序列需要一段与目标序列互补的长度约为 100 个核苷酸的向导 RNA（gRNA），同时需要在靶标序列对侧的 DNA 链上存在 5´-NNGRRT-3´（N = 任意，R = A 或 G）PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。EnGen Sau Cas9 核酸酶的 DNA 切割位点位于 PAM 序列 5´ 端约第 3 个碱基处。EnGen Sau Cas9 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猿猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

Sau Cas9 核酸酶序列识别与 DNA 切割示意图

EnGen® Sau Cas9 核酸酶 |

产品来源

EnGen® Sau Cas9 核酸酶来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），在大肠杆菌中表达，为 C 端含 6xHis 标签的融合蛋白。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0654T     -20    
        EnGen® Sau Cas9 M0654TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    20 mM Tris-HCl
    300 mM NaCl
    0.1 mM TCEP
    50% Glycerol
    pH 7.5 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 µM 约等于 2.54 mg/ml EnGen® Sau Cas9 核酸酶，1 µM 等于 0.127 mg/ml。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. How to synthesize a sequence-specific sgRNA for experiments using EnGen® Sau Cas9

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How can the genome editing efficiency be determined following EnGen® Sau Cas9 (NEB #M0654) transfections or microinjections?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Sau Cas9?
    3. Can the EnGen® sgRNA Synthesis Kit (NEB #E3322S) be used to synthesize sgRNAs specific for Sau Cas9?
    4. What is the sequence for a typical guide RNA specific for EnGen® Sau Cas9?
    5. How can I synthesize a sequence-specific sgRNA for experiments using EnGen® Sau Cas9?
    6. Why do I observe incomplete digestion with EnGen® Sau Cas9 and my target-specific Sau sgRNA in vitro?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?

EnGen® Seq1 Cas9 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen Seq1 Cas9 from Streptococcus equinus is an RNA-guided DNA endonuclease that catalyzes site-specific cleavage of double-stranded DNA (dsDNA). Targeting requires the formation of a ribonucleoprotein complex of Cas9 and a 116-nucleotide single guide RNA (sgRNA). The sgRNA encodes a 20-nucleotide sequence with complementarity to the DNA target strand immediately upstream of a 5´– NAGA –3´ protospacer adjacent motif (PAM) on the non-target strand. DNA cleavage by EnGen Seq1 Cas9 produces a double-stranded break occurring 3 nucleotides upstream of the PAM. EnGen Seq1 Cas9 has Simian virus 40 (SV40) T antigen nuclear localization signals (NLS) at both the N- and C-termini of the protein.

Figure 1. Schematic representation of S. equinus Cas9 nuclease complexed with a single guide RNA and target DNA

EnGen® Seq1 Cas9 |

S. equinus Cas9 (Seq1 Cas9) protein is shown in beige, single guide RNA (sgRNA) is depicted in blue, and the DNA is shown in grey, green, and red. The DNA target, or protospacer, is shown in green and the base pairing complementarity of the target strand with the guide RNA in the R-loop is illustrated. The protospacer adjacent motif (PAM) which is required for Cas9 binding to DNA is shown in red and the locations of DNA strand cleavage are indicated with black triangles.

产品来源

An E. coli strain that carries the cloned Cas9 gene from Streptococcus equinus with N- and C-terminal Simian virus 40 (SV40) T antigen nuclear localization signal (NLS) and a C-terminal 6XHis tag.

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0668T     -20    
        EnGen® Seq1 Cas9 M0668TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

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    • NEBuilder® 高保真 DNA 组装预混液
    • EnGen® 突变检测试剂盒

  • 注意事项

    1. 20 µM 等于 3.22 mg/ml

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of DNA with EnGen® Seq1 Cas9 (NEB #M0668)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where is the nuclear localization signal on EnGen® Seq1 Cas9 located?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Seq1 Cas9?
    3. What is the difference between EnGen® Seq1 Cas9, EnGen Sau Cas9 (NEB #M0654), and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    4. Why do I observe incomplete digestion/editing?
    5. Why does digestion/editing efficiency differ between two different single guide RNAs?
    6. Does NEB provide plasmids for sgRNA cloning?
    7. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?
    8. Can mutations generated with EnGen Seq1 Cas9 be detected using T7 Endonuclease I (NEB #M0302) or the EnGen Mutation Detection Kit (NEB #E3321S)?
    9.  Can sgRNA for use with EnGen Seq1 Cas9 be generated using the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes (NEB #E3322)?
    10. How do I design a single guide RNA for use with EnGen Seq1 Cas9?
    11. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |

EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 提供一种简单、快速的方法， 用户可以使用随附的试剂和自己设计的靶标特异 DNA 寡核苷酸在单次反应中转录大量 sgRNA， 反应用时仅需 30 分钟。

自然界中，S. pyogenes Cas9 的启动与 2 种 RNA 有关（crRNA 和 tracrRNA）。crRNA 又称 CRISPR RNA，包含大约 20 个核苷酸，位于 PAM（Protospacer Adjacent Motif）NGG 序列的上游，与目标 DNA 反义链同源互补。tracrRNA 又称 transactivating crRNA，tracrRNA 序列的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构可被 Cas9 识别。在实际操作中，将 tracrRNA 和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链引导 RNA（sgRNA）（1）,并与 Cas 9 形成复合体，识别并切割目标 DNA。

在 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 的 EnGen 2X sgRNA 反应混合液中，含有能被 S. pyogenes Cas 9 识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。对这两种寡核苷酸的重叠区域进行退火，然后使用 DNA 聚合酶进行填充，形成用于转录的双链 DNA（dsDNA）模板。双链 DNA 模板的合成和 RNA 转录在一个反应中完成，生成具有功能的 sgRNA。

1.    Jinek, M. et al. （2012）Science816 – 821 PubMed ID：22745249。

图 1：EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 的实验流程。

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |

图 2：EnGen sgRNA 合成试剂盒概览

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |

A. 特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子、~20 nt 目标特异性序列及与 S. pyogenes Cas9 识别支架序列互补的 14 nt 重叠区域（反应混合液中提供）。室温下，混合特异性目标链（或 EnGen sgRNA 调控序列）与 EnGen 2X sgRNA 反应预混液（NTPs、dNTPs、S. pyogenes Cas9 识别支架序列）及 EnGen sgRNA 酶预混液（DNA 和 RNA 聚合酶）。B. 在 37℃ 条件下，具有 14 nt 互补重叠区域的 2 个片段发生退火。C. DNA 聚合酶从 3´ 端开始延伸，形成一个双链 DNA 模板。D. RNA 聚合酶识别 T7 启动子及其下游的双链 DNA 并开始转录。最终形成的 sgRNA 包含目标特异片段、crRNA 和 tracrRNA。37℃ 条件下，单管反应 30 分钟即可完成所有步骤。 

图 3：使用 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 和几种不同的靶标特异性寡核苷酸（包括 EnGen sgRNA 对照寡核苷酸，S. pyogenes）合成的 sgRNA 示例。
EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |
RNA 在变性条件下用 10% Novex TBE-Urea 电泳胶检测，并使用 SYBR Gold 进行后染色。
图 4：合成 RNA 与体外转录 RNA 对比
EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |
使用 Lonza SF 细胞系 4D-Nucleofector™ 试剂盒对 293T 细胞进行电穿孔。48 小时后，用 Epicentre QuickExtract™ 提取 DNA。使用 EnGen 突变检测试剂盒（NEB #E3321S）确定修饰百分比
产品类别:
sgRNA Synthesis Reagents and Kits Products,
Genome Editing Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3322V     -20    
        EnGen® sgRNA Enzyme Mix M3322AVIAL -20 1 x 0.04 ml Not Applicable
        EnGen® 2X sgRNA Reaction Mix, S. pyogenes N3320SVIAL -20 1 x 0.1 ml Not Applicable
        DNase I (RNase-free) M0303AAVIAL -20 1 x 0.04 ml 2,000 units/ml
        EnGen® sgRNA Control Oligo, S. pyogenes S3321AVIAL -20 1 x 0.02 ml 1 µM
        Dithiothreitol (DTT) B1222AVIAL -20 1 x 0.5 ml 100 mM
    • E3322S     -20    
        EnGen® sgRNA Enzyme Mix M3322AVIAL -20 1 x 0.04 ml Not Applicable
        EnGen® 2X sgRNA Reaction Mix, S. pyogenes N3320AVIAL -20 1 x 0.2 ml Not Applicable
        DNase I (RNase-free) M0303AAVIAL -20 1 x 0.04 ml 2,000 units/ml
        EnGen® sgRNA Control Oligo, S. pyogenes S3321AVIAL -20 1 x 0.02 ml 1 µM
        Dithiothreitol (DTT) B1222AVIAL -20 1 x 0.5 ml 100 mM

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    靶标特异性 DNA 寡核苷酸
    热循环仪/37℃ 加热块/温育器
    无核酸酶水
    RNA 定量设备和试剂
    RNA 纯化离心柱（如 NEB #T2040）
    无 RNase 管、防气溶胶吸头
    微型离心机

    可选材料：
    小牛肠碱性磷酸酶（CIP）
    Spy Cas9 核酸酶
    EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶
    电泳胶、电泳缓冲液、凝胶上样染料、RNA 和 DNA Ladder、凝胶盒

  • 相关产品

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    • Spy Cas9 核酸酶
    • EnGen® Spy Cas9 NLS 核酸酶
    • EnGen® Spy Cas9 切刻酶
    • EnGen® Spy dCas9（SNAP-tag）核酸酶
    • EnGen® 突变检测试剂盒
    • 低分子量 ssRNA Ladder
    • 2X RNA 上样染料
    • 6X 紫色凝胶上样染料
    • 1 kb Plus DNA Ladder
    • T2040 Monarch RNA Cleanup Kit 50 ug

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. EnGen® sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes Protocol (NEB #E3322)
    2. Transfection of Cas9 RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3322

工具 & 资源

  • Web 工具

    • EnGen sgRNA Template Oligo Designer

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. The sgRNA is not running as a single band on the gel – why is this happening?
    2. Is it necessary to add a “G” into the oligo following the T7 promoter sequence?
    3. Is it necessary to DNase treat my sgRNA synthesis reaction?
    4. Why is my sgRNA not exhibiting 100% in vitro Cas9 cleavage activity?
    5. Is it necessary to phosphatase treat my sgRNAs?
    6. The sgRNA is not running as a single band on the gel – why is this happening?
    7. Will the sgRNAs synthesized from this kit (NEB #E3322S) be recognized by homologs of Cas9 from different organisms?
    8. Do I include the PAM(NGG) in my sgRNA sequence?
    9. What is the sequence of the control oligo provided with the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes?
    10. Is the Monarch RNA Cleanup Kit (NEB #T2040) compatible with the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes?
    11. Is it necessary to add the provided DTT to the sgRNA synthesis reaction?