产品信息

• 产品组分信息

  本产品提供以下试剂或组分：

  NEB #	名称	组分货号	储存温度	数量	浓度
  B0374S     -20       Isothermal Amplification Buffer II Pack B0374SVIAL -20 4 x 1.5 ml 10 X

• 特性和用法

  1X 缓冲液组分

  20 mM Tris-HCl
  10 mM (NH₄)₂SO₄
  150 mM KCl
  2 mM MgSO₄
  0.1% Tween® 20
  pH 8.8@25°C

• 注意事项

  1. 反应条件：1X 浓度的反应缓冲液，确保 Bst 3.0 DNA 聚合酶的最佳活性。

FAQs & 问题解决指南

• FAQs

  1. Which enzyme should I use with Isothermal Amplifiction Buffer II?
  2. When I thaw Isothermal Amplification Buffer II I see a lot of white precipitate, is this normal?

产品信息

如图 1 所示，糖基化是最常见的一种蛋白质翻译后修饰。当聚糖链附着在核心蛋白上的天冬酰胺残基上时，形成 N-连接糖基化。当聚糖链附着在丝氨酸或苏氨酸残基上时，形成 O-连接糖基化。可使用化学法或酶促法从糖蛋白中去除寡糖。但是，化学方法（例如使用弱碱或温和的肼解进行 β -消除）处理过于剧烈，并可能导致糖基去除不完全和蛋白质降解；酶促法则更温和，可以在不降解蛋白质的情况下实现糖基的完全去除。

PNGase F 是去除糖蛋白中几乎所有 N-连接寡糖的最有效的酶促法。PNGase F 可将天冬酰胺残基脱氨基为天冬氨酸，从而切出完整的寡糖，后者可用于进一步分析。某些植物和昆虫的寡糖中含有一个通过 α(1-3) 键与核心糖链相连的岩藻糖，这种结构可抵抗 PNGase F 的切割活性。

要去除 O-连接糖链，必须通过一系列糖苷外切酶去除单糖，直到附着在丝氨酸或苏氨酸上的核心仅剩 Galβ1-3GalNAc（核心 1）和/或 GlcNAcβ1-3GalNAc（核心 3）为止。NEB O-糖苷酶克隆自粪肠球菌（Enterococcus faecalis），可以去除这些没有修饰的丝氨酸或苏氨酸残基的核心结构。任何对核心结构的修饰，包括唾液酸化，都会阻断 O-糖苷酶的作用。唾液酸残基很容易被 α2-3,6,8,9 神经氨酸苷酶 A 去除。此外，可在去糖基化反应中加入 β(1-4) 半乳糖苷酶 S 和 β-N-乙酰氨基己糖苷酶 _f 等糖苷外切酶，以便去除存在于核心结构上的其它复杂修饰。这种酶结合可能无法去除所有 O-连接寡糖，但应能去除许多常见的寡糖结构。

蛋白去糖基化混合液 II 包含去除所有 N-连接、简单 O-连接糖链以及一些复杂 O-连接糖链所需的所有酶、试剂和对照品。该产品中的酶能用于 20 次反应或处理 2 mg 糖蛋白。蛋白去糖基化混合液 II 中包含的所有酶和试剂都与质谱兼容。在去糖基化处理后，样品可直接进行质谱分析。

图 1： 经 O-连接和 N-连接糖基化修饰的糖蛋白。

图 2

蛋白去糖基化混合液 II：
PNGase F（无甘油），重组酶：
10,000 unit/管

O-糖苷酶：
80,000 unit/管

α2-3,6,8,9 神经氨酸苷酶 A：
400 unit/管

β1-4 半乳糖苷酶 S：
960 unit/管

β-N-乙酰氨基己糖苷酶_f：
300 unit/管

底物对照：
胎球蛋白，0.5 mg（含有唾液酸化的 N-连接和 O-连接糖链）

蛋白去糖基化混合液 II 中包含以下酶
O-糖苷酶（NEB #P0733）又称 α-N-乙酰氨基半乳糖苷内切酶，是克隆自粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的重组酶（1）。该酶可以从糖蛋白中切除核心 1 和核心 3 型 O-连接二糖。分子量约 147 kDa。

PNGase F（无甘油），重组酶（NEB #P0709），也称为肽：N-糖苷酶 F，克隆自米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola，旧称 Flavobacterium meningosepticum），在 E. coli 中表达（2）。PNGase F（无甘油），重组酶是一种酰胺酶，可以在无 α(1-3) 岩藻糖基化的 N-连接糖蛋白的高甘露糖型、杂合型和复合型寡糖最内侧 GlcNAc 和天冬酰胺残基之间进行切割。分子量约 36 kDa。

α2-3,6,8,9 神经氨酸苷酶 A（NEB #P0722）又称唾液酸酶 A，是一种克隆自产脲节杆菌（Arthrobacter ureafaciens）的重组酶，在 E. coli 中表达（3）。该酶可催化水解糖蛋白和寡糖中 α2,3、α2,6、α2,8 和 α2,9 连接的 N-乙酰神经氨酸残基。分子量约 100 kDa。

β1-4 半乳糖苷酶 S（NEB #P0745）是一种克隆自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的重组酶，在 E. coli 中表达（4）。该酶是一种具有高度特异性的糖苷外切酶，催化水解寡糖上 β1-4 连接的半乳糖残基。分子量约 231 kDa。

β-N-乙酰氨基己糖苷酶 _f（NEB# P0721）是一种克隆自褶皱链霉菌（Streptomyces plicatus）（5）的重组酶，在 E. coli 中过表达（6）。该酶可催化水解寡糖末端 β-N-乙酰氨基半乳糖和氨基葡糖残基。分子量约 100 kDa。

产品类别:

Exoglycosidases Products,

Endoglycosidases Products,

Proteome Analysis Products

应用:

Expression Systems,

Glycan Sequencing,

Protein Digestion,

Recombinant Glycoprotein Expression,

Glycoprotein Analysis

• 产品组分信息

  本产品提供以下试剂或组分：

  NEB #	名称	组分货号	储存温度	数量	浓度
  P6044S     -20       Protein Deglycosylation Mix II P6044SVIAL -20 1 x 0.1 ml 20 reactions   Deglycosylation Mix Buffer 1 B6044SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X   Deglycosylation Mix Buffer 2 B6045SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X   Fetuin P6042SVIAL -20 1 x 0.05 ml 10 mg/ml

• 特性和用法

  贮存溶液

  50 mM NaCl
  20 mM Tris-HCl
  2.6 mM EDTA
  pH 7.5 @ 25°C

  热失活

  65°C for 20 minutes

• 优势和特性

  应用特性

  蛋白去糖基化混合液 II 包含去除所有 N-连接、简单 O-连接糖链以及一些复杂 O-连接糖链所需的所有酶、试剂和对照品。该产品中的酶能用于 20 次反应或处理 2 mg 糖蛋白。蛋白去糖基化混合液 II 中包含的所有酶和试剂都与质谱兼容。

• 相关产品

  相关产品

  • p0709-pngase-f-glycerol-free-recombinant
  • p0733-o-glycosidase
  • α2-3,6,8,9 神经氨酸苷酶 A
  • β1-4 半乳糖苷酶 S
  • β-N–乙酰氨基己糖苷酶 _f
  • α1-2 岩藻糖苷酶
  • α1-3,4 岩藻糖苷酶
  • β1-3 半乳糖苷酶
  • α-N-乙酰半乳糖胺酶

• 注意事项

  1. 蛋白去糖基化混合液 II 提供两种不同的反应缓冲液。请参考“操作说明、说明书 & 用法”菜单，了解与各个缓冲液系统相关的操作说明。当需要使用非变性条件时，请使用 10X 去糖基化混合缓冲液 1（NEB #B6044）。10X 去糖基化混合缓冲液 2（NEB #B6045）虽会还原糖蛋白，但能实现最高效且最完整的去糖基化水平。如果无需非变性条件，则推荐使用 10X 去糖基化混合缓冲液 2。
  2. 不建议将蛋白去糖基化混合液 II 用于粘蛋白样底物。

• 参考文献

  1. Koutsioulis, D. Landry, D. and Guthrie, E.P. (2008). Glycobiology. 18, 799-805.
  2. Plummer, T.H. Jr. and Tarentino, A.L. (1991). Glycobiology. 1, 257-263.
  3. McLeod, E. New England Biolabs, Inc. Unpublished observation
  4. Chen, M. New England Biolabs, Inc. Unpublished observation
  5. Robbins, P. et al. (1992). Gene. 111, 69-76.
  6. Guan, C. and Wong, S. New England Biolabs, Inc. Unpublished observation

操作说明、说明书 & 用法

• 操作说明

  1. Reaction Protocols for Protein Deglycosylation Mix II (P6044)

• 应用实例

  • Analysis of a Fusion Protein using the Protein Deglycosylation Mix II and Mass Spectrometry

工具 & 资源

• 选择指南

  • Endoglycosidase Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

• FAQs

  1. What is the difference between the discontinued Protein Deglycosylation Mix (NEB# P6039) and the new Protein Deglycosylation Mix II (NEB# P6044)?
  2. Two different reaction buffers (10X Deglycosylation Mix Buffer 1 and 2) are supplied with the Protein Deglycosylation Mix II. How do I know which buffer to use?
  3. Are downstream analysis such as HPLC and Mass Spectrometry compatible with the Protein Deglycosylation Mix II?
  4. I tried the Protein Deglycosylation Mix II on my glycoprotein and didn’t see removal of the carbohydrate. What could be the problem?
  5. How much Protein Deglycosylation Mix II should I use to remove the carbohydrates under native (non-denaturing) conditions?
  6. What is a good control substrate for the Protein Deglycosylation Mix II?
  7. Are Protease Inhibitors acceptable for use with the Protein Deglycosylation Mix II reaction?