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EnGen® Spy Cas9 NLS 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶是一种 RNA 介导的核酸内切酶，可催化双链 DNA 的位点特异性切割。该酶可识别 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列（1）的 NGG 处，并在靶标序列的 3 个碱基内进行切割。PAM 序列的 NGG 必须连在基因编辑靶标位点之后，位于与 sgRNA 序列互补的 DNA 的链上。EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

使用 Cas9 RNP 复合物注射方法提高了基因组编辑效率

EnGen® Spy Cas9 NLS 核酸酶 |
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有表达带双端（N 端和 C 端）核定位序列（NLS）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框。通过 TransIT-X2（Mirus）转染试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端（N 端和 C 端）核定位序列（NLS），使用 TransIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。Cas9 RNPs 使用脂质体 RNAiMAX（Life Technologies）进行反向转染，RNP 的终浓度为 10 nmol。Cas9 的蛋白序列中不含核定位序列（NLS）。EnGen Cas9 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有核定位序列。编辑效率通过 T7 核酸内切酶 I 实验进行分析，结果以修饰百分比进行统计。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 基因，在其编码蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）核定位序列（NLS），N 端同时带有 6xHis 标签。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0646T     -20    
        EnGen® Spy Cas9 NLS M0646TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0646M     -20    
        EnGen® Spy Cas9 NLS M0646MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 μM 等于 3.22 mg/ml

  • 参考文献

    1. Jinek M. et al. (2012). Science. 816-821. DOI: 10.1126/Science.1225829. Epub 2012 Jun 28 PubMedID: 22745249,

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of DNA with EnGen Spy Cas9 NLS (M0646)
    2. Protocol for Electroporation of EnGen® SpyCas9 NLS, S. pyogenes RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lonza 4D-Nucleofector™ System
    3. Transfection of Cas9 RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX
    4. Electroporation of EnGen® Spy Cas9 NLS RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Neon® Electroporation System
    5. In vitro digestion of plasmid DNA with EnGen SpRY Cas9 (NEB #M0669)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where is the nuclear localization signal on EnGen® Spy Cas9 NLS located?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Spy Cas9 NLS?
    3. What is the difference between EnGen® Spy Cas9 NLS (NEB #M0646) and Cas9 NLS, S.pyogenes (NEB #M0641)?
    4. Why do I observe incomplete digestion?
    5. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    6. Does NEB provide plasmids for gRNA cloning?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?

EnGen® Spy dCas9（SNAP-tag）核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen® Spy dCas9 核酸酶是 Cas9 核酸酶的无活性突变体，保留了与 DNA 的结合活性（1,2）。该核酸酶包含 D10A 和 H840A 这两个点突变，可分别导致 RuvC 与 HNH 核酸酶结构域失活。N 端 SNAP-tag® 标签可与荧光基团、生物素和许多其它利于可视化和靶标富集的偶联物共价结合。与 Cas9 核酸酶一样，EnGen Spy dCas9 核酸酶结合 DNA 需要与靶标序列互补的向导 RNA，并且 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列的 NGG 必须位于靶标序列下游。EnGen Spy dCas9 核酸酶蛋白的 C 端含有 SV40 T 抗原核定位序列（NLS）。

产品来源

EnGen® Spy dCas9 核酸酶在大肠杆菌中表达为 N 端含 6xHis 标签的融合蛋白。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0652S     -20    
        EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) M0652SVIAL -20 1 x 90 pmol 1 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0652T     -20    
        EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) M0652TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

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    • EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes
    • e2050-hiscribe-t7-quick-high-yield-rna-synthesis-kit

  • 注意事项

    1. 20 µM 约等于 3.6 mg/ml，1 μM 约等于 0.18 mg/ml EnGen® Spy dCas9 核酸酶。
    2. 本产品兼容稀释缓冲液 B：含有 300 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、500 µg/ml BSA 和 50% 甘油（pH 7.4 @ 25℃）。

  • 参考文献

    1. Qi, LS., et. al. (2013). Cell. 152 (5), 1173-83.
    2. Qi, LS., et. al. (2013). Cell. 154 (2), 442-51.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Transfection of Cas9 RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where is the nuclear localization signal on SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes located?
    2. Which nuclear localization signal is fused to SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes?
    3. What inactivating mutations were made in SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes?
    4. Why do I observe incomplete binding with SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes?
    5. Why does binding efficiency differ between two different guide RNAs?
    6. Does NEB provide plasmids for sgRNA cloning?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?

Spy Cas9 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

Spy Cas9 核酸酶 |

Spy Cas9 核酸酶 |

    
Spy Cas9 核酸酶是一种 RNA 介导的核酸内切酶，可催化双链 DNA 的位点特异性切割。该酶可识别 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列（1）的 NGG 处，并在靶标序列的 3 个碱基内进行切割。PAM 序列的 NGG 必须连在基因编辑靶标位点之后，位于与 sgRNA 序列互补的 DNA 的链上。

体内 Cas9 过程：细菌获得性免疫 Spy Cas9 核酸酶 |
细菌基因组中的 CRISPR 位点被转录并加工成 crRNA。它和另外的 tracrRNA 一起，与 Cas9 核酸内切酶复合物，切割含有与 crRNA 序列互补的外源 DNA，互补序列长度为 20 nt，与 PAM 序列相邻。（图中未按比例绘制。）
Spy Cas9 核酸酶与 sgRNA 形成复合物 Spy Cas9 核酸酶 |
切割位点位于 PAM 序列上游的三个核苷酸处（以红色显示）。PAM 位于与 sgRNA 序列互补的 DNA 的链上。
使用 Spy Cas9 核酸酶 进行体外 DNA 切割Spy Cas9 核酸酶 |
根据推荐条件建立反应体系，用 1% TBE 琼脂糖凝胶分离切割产物。起始 DNA 为 PvuII 线性化的 pBR322 质粒 DNA。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 基因

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0386S     -20    
        Cas9 Nuclease, S. pyogenes M0386SVIAL -20 1 x 90 pmol 1 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0386T     -20    
        Cas9 Nuclease, S. pyogenes M0386TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0386M     -20    
        Cas9 Nuclease, S. pyogenes M0386MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 2 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

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    • EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes
    • EnGen® 突变检测试剂盒

  • 注意事项

    1. 1,000 nM 等于 159 ng/μl。
    2. 如果需要使用高浓度 Spy Cas9 核酸酶（M0386T 和 M0386M）用于体外 DNA 酶切，需要在配制反应体系之前，使用稀释液 B（NEB #B8002S）将酶稀释至 1 µM。

  • 参考文献

    1. Jinek M. et al. (2012). Science. 816-821 doi: 10.1126/Science.1225829. Epub 2012 Jun 28.. PubMedID: 22745249

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of DNA with Cas9 Nuclease, S. pyogenes (M0386)
    2. Using recombinant Cas9 nuclease to assess locus modification in genome editing experiments (#M0386)

  • 应用实例

    • Bridging dsDNA with a ssDNA Oligo and NEBuilder® HiFi DNA Assembly to create an sgRNA-Cas9 Expression Vector
    • Protocol for using Recombinant Cas9 Nuclease to Assess Locus Modification in Genome Editing Experiments

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Why do I observe incomplete digestion?
    2. Why does digestion efficiency differ between two SgRNAs?
    3. Does NEB provide plasmids for gRNA cloning?
    4. Does Cas9 Nuclease contain a nuclear localization signal (NLS)? 
    5. Is Cas9 Nuclease fused with a N-terminal 6XHis tag?
    6. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    7. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶为 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶的高保真突变体，基因克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），含有 4 个突变位点（N497A/R661A/Q695A/Q926A），可显著减少 DNA 的非特异性切割。Spy Cas9 核酸酶是一种由 RNA 引导的核酸内切酶，可在靶向位点特异切割双链 DNA。单向导 RNA（sgRNA）将 Cas9 靶向 5´-NGG-3´ PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列上游的区域，并在 PAM 上游的第 3 个碱基外进行双链切割（1）。EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

图 1：sgRNA 引导Spy Cas9 核酸酶切割靶标 DNA 示意图

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

S. pyogenes Cas9 (Spy Cas9) 蛋白以米色显示，sgRNA 以蓝色显示，DNA 以灰色、绿色和红色显示。DNA 靶标以及前间隔序列以绿色显示，图中 R-loop 区域展示了靶标序列与向导 RNA 互补配对。Cas9 与 DNA 结合所需的 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列以红色显示，以黑色三角标注 DNA 的切割位置。橙色标签标注了 Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶（2）中突变氨基酸的相对位置，这些突变氨基酸与靶标 DNA 的结合位点位于 RNP-DNA 复合物中 PAM 的远端区域。

图 2：EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶针对于三个不同靶基因的编辑效率和脱靶率

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

通过二代测序技术确定 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶的保真度。首先在 Nucleofector 核转染系统中预制 RNP 复合物，Cas9 浓度为 2 μM，sgRNA 浓度为 4 μM；然后将 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶（野生型）和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶的 RNPs 复合物电转入 1×105 HEK293 细胞中，靶向位点为 EMX1 (A)、FANCF (B) 和 ZSCAN2 (C)（2）。电穿孔后 48–72 小时，从电穿孔细胞中提取基因组 DNA，并对靶基因和之前用 GUIDESeq （2） 鉴定的 7 种脱靶位点进行 PCR 扩增 DNA。使用 NEBNext® Ultra™ II DNA 文库制备试剂盒和 NEBNext 多样本接头引物试剂盒，将扩增产物构建为 Illumina® 测序文库。使用 CRISPResso 2（3）分析测序数据。结果分别展示了 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶（野生型）、EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶和非靶向对照对靶向位点和 7 个脱靶位点（1–4 个碱基替换）切割比例。图中列出了每个靶基因序列，其中 PAM 以金色框表示，与脱靶相关的碱基替换位点以绿色框表示，如果碱基替换发生在 PAM 序列的可变区，则以灰色框表示。该测试设置 3 个平行试验。误差线表示标准差。

图 3：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基替换更加敏感

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log2 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。将上述 log2 值以热点图形式绘制，横轴对应碱基替换的位置和类型，蓝点高度对应 log2 值。

图 4：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基插入更加敏感

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log2 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。结果图中，X 轴为碱基插入位置，Y 轴为 log2 值 对于单碱基差异序列，每个位置的插入碱基类型用彩色圆点表示。

图 5：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基缺失更加敏感

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log2 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。结果图中，X 轴为碱基缺失位置，Y 轴为 log2 值 对于单碱基差异序列，每个位置的缺失碱基类型用彩色圆点表示。

 

产品来源

An E. coli strain that carries the cloned Cas9 gene from Streptococcus pyogenes with N- and C-terminal Simian virus 40 (SV40) T antigen nuclear localization signal (NLS) and a N-terminal 6XHis tag.

产品类别:
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0667M     -20    
        EnGen® Spy Cas9 HF1 M0667MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0667T     -20    
        EnGen® Spy Cas9 HF1 M0667TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 µM 等于 3.22 mg/ml

  • 参考文献

    1. Jinek M. et al (2012). Science. 816-821. DOI: 10.1126/Science.1225829. Epub 2012 Jun 28 PubMedID: 22745249
    2. Kleinstiver, B.P. and Pattanayak, V., et al. (2016). Nature. 529, 490-495.
    3. Clement, K., et al. (2019). Nat Biotechnol . 37, 224-226.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of DNA with EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667)
    2. Electroporation of EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) into adherent cells using the Lonza 4D-Nucleofector™ System
    3. Transfection of EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX System
    4. Electroporation of EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) into adherent cells using the Neon® Electroporation System
    5. In vitro digestion of plasmid DNA with EnGen SpRY Cas9 (NEB #M0669)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where is the nuclear localization signal on EnGen® Spy Cas9 HF1 located?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Spy Cas9 HF1?
    3. What is the difference between EnGen® Spy Cas9 HF1 and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    4. Why do I observe incomplete digestion/editing with EnGen® Spy Cas9 HF1?
    5. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    6. Does NEB provide plasmids for gRNA cloning?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?