EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen SpRY Cas9 核酸酶来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），是一种经改造的、RNA 介导的 DNA 内切酶，可催化双链 DNA（dsDNA）的位点特异性切割。靶向需要约 100 个核苷酸的单链向导 RNA（sgRNA），与双链 DNA 底物上 PAM（Protospacer Adjacent Motif）上游的 20 nt 区域互补。EnGen SpRY Cas9 编码 11 个点突变（A61R、L1111R、D1135L、S1136W、G1218K、E1219Q、N1317R、A1322R、R1333P、R1335Q、T1337R），旨在降低对 PAM 的要求。与野生型 Spy Cas9 的经典 5´-NGG-3´ PAM 不同，SpRY Cas9 经证明在体外几乎没有 PAM 序列要求，能在许多具有 5´-NNN-3´ PAM 的位点上进行切割（尽管在体内与 5´-NYN-3´ PAM 相比，它表现出对 5´-NRN-3´ 的偏好）（1,2）。EnGen SpRY Cas9 核酸酶进行的 DNA 切割会在 PAM 上游 3 nt 处产生双链断裂。EnGen SpRY Cas9 核酸酶蛋白的 C 端含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

图 1：EnGen SpRY Cas9 核酸酶在体外对双链 DNA 靶向切割没有序列限制

EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |

EnGen SpRY Cas9 是来自化酿脓链球菌的 Cas9 核酸酶的变体，在 PAM 作用结构域内有多个点突变（1）。与野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在体外应用中，可以在任何三核苷酸序列上游 3 nt 处产生双链断裂。

图 2：使用 EnGen SpRY Cas9 核酸酶和 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液可以简化大载体克隆实验流程


EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |

EnGen® SpRY Cas9 切割灵活性演示。A) 标有限制性内切酶 BsrGI 识别位点的 pXba 示意图。矩形框中显示了 BsrGI 识别序列，其切割位点用红色三角形表示。B) 用于靶向 pXba 中 BsrGI 位点的三种 sgRNA 序列。EnGen SpRY Cas9 和 BsrGI 的切割位点均用红色三角形表示。SpRY Cas9 非经典 PAM 以黄色文本表示。C) 在 1X NEBuffer r3.1 中，用 10 个单位的 BsrGI 或 1 µM EnGen SpRY Cas9 以及靶向 pXba 中所有三个 BsrGI 位点的三种 sgRNA 各 1 µM 消化 1 µg pXba（22,563 bp）。所有反应体系先在 37℃ 下温育 1 小时，然后再在 80℃ 下温育 5 分钟。使用 Agilent gDNA ScreenTape 系统，在 4200 TapeStation 仪器上通过凝胶电泳比较 BsrGI 和 SpRY 消化后产物 DNA 条带。BsrGI 和靶向 BsrGI 位点的 SpRY Cas9 对 pXba 的切割产生了几乎相同的条带图谱。使用浓度低至 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 sgRNA 消化 1 µg pXba 产生的切割与使用 1 µM 的结果相似。未消化的 pXba 作为对照进行电泳，但环状 DNA 在 gDNA ScreenTape 系统中不能精确的按照大小进行分离。垂直灰线标记了两个不同 ScreenTapes 的使用位置。

图 3：使用 EnGen SpRY Cas9 对 22.6 kb 质粒进行线性化，然后使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液进行克隆。


EnGen® SpRY Cas9 核酸酶 |

确定 EnGen SpRY Cas9 核酸酶消化产物是否适用于后续的 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液反应。A) 线性化和克隆方案的示意图。在 1X NEBuffer r3.1 中，使用 50 nM EnGen SpRY Cas9 和 50 nM sgRNA（靶向序列 5´-CTTTTTGAGCAAACATGTCC-3´），在 37℃ 条件下反应 1 小时，将 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII orf 起始密码子的下游进行线性化。在继续进行 DNA 组装之前，线性化质粒可以选择经过离心柱纯化或不纯化。根据推荐的操作说明，使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液试剂盒，将编码核定位序列（NLS）标签的寡核苷酸插入 pVII 中。B) 使用 Agilent gDNA ScreenTape 系统检查 EnGen SpRY Cas9 核酸酶消化后的线性化 pXba（纯化和未纯化的）。未消化的 pXba 作为对照进行电泳，但环状 DNA 在 gDNA ScreenTape 系统中不能精确的按照大小进行分离。C) 使用纯化或未纯化的 EnGen SpRY Cas9 消化产物进行 DNA 组装反应，统计转化后长出的克隆数。包括无插入片段对照，以定性评估 EnGen SpRY Cas9 未消化的质粒产生了多少转化子。在 DNA 组装反应之前，对线性化 pXba 的纯化降低了背景菌落的百分比。从纯化和未纯化 EnGen SpRY Cas9 消化产物中挑选 8 – 9 个转化子菌落，使用跨越插入片段的引物进行 PCR，以检查 DNA 组装是否正确。纯化和未纯化的 EnGen SpRY Cas9 消化产物，其产生的克隆 100% 显示正确的序列插入（数据在此未显示）。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 基因，在其编码蛋白的 C 端含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS），C 端同时带有 6xHis 标签

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0669T     -20    
        EnGen® SpRY Cas9 M0669TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0669M     -20    
        EnGen® SpRY Cas9 M0669MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 µM 等于 3.25 mg/ml

  • 参考文献

    1. Walton, et al. (2020). Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. Apr 17;368(6488), 290-6. DOI: 10.1126/science.aba8853
    2. Christie, et al. (2023). Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat. Biotechnol.. Mar 41, 409-16. DOI: 10.1038/s41587-022-01492-y

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of plasmid DNA with EnGen SpRY Cas9 (NEB #M0669)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Why is it called EnGen SpRY Cas9?
    2. What is the difference between EnGen SpRY Cas9, EnGen Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    3. How do I design a single guide RNA for use with EnGen SpRY Cas9?
    4. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    5. Why do I observe incomplete digestion/editing?
    6. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    7.  Is it necessary to clean up my reaction before using the digestion products with NEBuilder?
    8. Where is the nuclear localization signal on EnGen SpRY Cas9 located?
    9. Which nuclear localization signal is fused to EnGen SpRY Cas9?
    10. Does NEB provide plasmids for guide RNA cloning?
    11. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?