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Q5® 反应缓冲液套装 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

Q5® 反应缓冲液套装 |  

NEB 公司提供 5X 反应缓冲液和补充试剂，适用于 Q5® 超保真 DNA 聚合酶和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶。

产品类别:
Reaction Buffers Products,
Q5® High-Fidelity DNA Polymerases Products,
Buffers Products

应用:
Long Range PCR,
Fast PCR,
High-Fidelity PCR,

Multiplex PCR,
Specialty PCR,
Routine PCR,
PCR,

Fast Cloning: Accelerate your cloning workflows with reagents from NEB

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • B9027S     -20    
        Q5® Reaction Buffer Pack B9027SVIAL -20 4 x 1.5 ml 5 X
        Q5® High GC Enhancer B9028AVIAL -20 4 x 1.5 ml 5 X

  • 相关产品

    相关产品

    • dNTP 混合液
    • dNTP 套装
    • Q5® 超保真 2X 预混液
    • Q5® 超保真 DNA 聚合酶
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • MgCl2 溶液

  • 注意事项

    1. 反应条件：
      在 1X 的反应缓冲液中含有 2 mM Mg++，可确保 Q5 超保真 DNA 聚合酶和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶的最佳活性。

  • 参考文献

    1. Anastassia Voronova Erin Coyne, Ashraf Al Madhoun, Joel V. Fair, Neven Bosiljcic, Catherine St-Louis, Grace Li, Sherry Thurig, Valerie A. Wallace, Nadine Wiper-Bergeron, and Ilona S. Skerjanc. (2013). Hedgehog Signaling Regulates MyoD Expression and Activity. J Biol Chem. 288(6), 4389–4404. PubMedID: PMC3567689
    2. Lieve Naesens, Luke Guddat, Dianne Keough, André B.P. van Kuilenburg, Judith Meijer, Johan Vande Voorde and Jan Balzarini (2013). ROLE OF HUMAN HYPOXANTHINE GUANINE 
      PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE IN ACTIVATION 
      OF THE ANTIVIRAL AGENT T-705 (FAVIPIRAVIR). Molecular Pharmacology Fast Forward. 87247,
    3. Hicham Bouabe, Klaus Okkenhaug (2013). A Protocol for Construction of Gene Targeting Vectors and Generation of Homologous Recombinant Embryonic Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1064, 337-354.

操作说明、说明书 & 用法

  • 使用指南

    • Activity of Restriction Enzymes in PCR Buffers

工具 & 资源

  • Web 工具

    • Tm Calculator

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Do other polymerases work in Q5® Reaction Buffer?
    2. There is a precipitate in the bottom of the Master Mix tube? Is this normal?

Q5® 定点突变试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

Q5 定点突变试剂盒可以在 2 小时内快速对双链质粒 DNA 进行定点突变（图 1）。该试剂盒使用稳定的 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶，结合客户自行设计的引物，在各种质粒中引入插入、缺失和替换突变。PCR 后将扩增材料直接添加到独特的激酶-连接酶-DpnI（KLD）酶混合液中，进行快速室温环化和模板去除（5 分钟）（图 2）。转化到高效级 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（随试剂盒提供），以确保转化长度至少为 20 kb 的质粒能获得稳定的结果。

图 1：2 小时内完成定点突变。Q5® 定点突变试剂盒 |
使用预混液、独特的多酶 KLD 酶混合液和快速聚合酶可确保大多数质粒的突变反应在两小时内完成。

 

图 2：Q5 定点突变试剂盒概览。 Q5® 定点突变试剂盒 |
此试剂盒经优化设计，可快速有效地将插入、缺失和替换引入双链质粒 DNA。第一步是使用常规引物和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶的预混液进行指数扩增。第二步是使用含有激酶、连接酶和 DpnI 的独特酶混合液一起温育。在这些酶的共同作用下，可实现 PCR 产物快速环化，并去除模板 DNA。最后一步是转化到高效级化学感受态细胞（随试剂盒提供）。
图 3：Q5 定点突变试剂盒引物设计Q5® 定点突变试剂盒 |
使用专门设计的正向（黑色）和反向（红色）引物，将替换、缺失和插入引入质粒 DNA。与依赖线性扩增的试剂盒不同，为 Q5 定点突变试剂盒设计的引物不会重叠，从而可以确保实现
指数扩增的优势。A）通过在正向引物的中间引入所需更换的核苷酸（* 表示）来产生替换，在突变的 3´ 侧应包含至少 10 个互补核苷酸序列。设计的反向引物应让两条引物的 5´ 末端背靠背退火。B）通过对删除区域两侧设计标准的、非突变正向和反向引物，来进行缺失改造。C）将少于或等于 6 个核苷酸的插入引入正向引物的 5´ 末端，同时反向引物与正向引物的互补区域的 5´ 末端背靠背退火。D）可以通过将所需插入序列的一半引入两条引物的 5´ 末端以实现更大片段的插入。插入片段的大小上限很大程度上取决于寡核苷酸合成的限制。
图 4：NEB Q5 SDM 试剂盒比 Agilent QuikChange® SDM 试剂盒的转化效率更高
Q5® 定点突变试剂盒 |
图中显示了使用背靠背对照 SDM 引物混合液和对照 SDM 质粒（6.7 kb）进行的替换反应（4 nt）的结果，以及 12 nt 缺失实验（5.8 kb 质粒）和 18 nt 插入实验（7.0 kb 质粒）的结果。在这三种实验中，得到菌落的预期突变效率在 90% 以上。如果细胞在涂板前未稀释，则将结果标准化为转化子总数。为了进行比较，使用 QuikChange Lightning 定点突变试剂盒（Agilent）按照 Agilent 操作流程进行相同的替换反应（4 nt），并使用 Agilent 引物设计工具设计重叠引物。

*请注意，QuikChange 试剂盒不适用于这种大小的缺失和插入，因此无法对这些实验进行比较。

产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
Site Directed Mutagenesis,
Site Directed Mutagenesis

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E0554S     Multi-temperature    
        Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix M0494AVIAL -20 1 x 0.125 ml 2 X
        KLD Reaction Buffer B0554AVIAL -20 1 x 0.15 ml 2 X
        KLD Enzyme Mix M0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 10 X
        Control SDM Primer Mix S0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 10 µM
        Control SDM Plasmid N0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 5 µg/ml
        pUC19 Vector N3041AVIAL -20 1 x 0.025 ml 50 pg/µl
        SOC Outgrowth Medium B9020SVIAL 4 1 x 25 ml Not Applicable
        NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) C2987HVIAL -80 10 x 0.05 ml Not Applicable

  • 优势和特性

    Features

    • 在质粒 DNA 中引入突变、插入或缺失
    • 非重叠的引物设计保证高效的指数扩增，并从多种模板中产生高百分比的期望突变
    • 分子内连接及转化到 NEB 高效级感受态细胞可得到较多菌落
    • Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶错配率极低，可缩短筛选时间
    • 热启动聚合酶可实现室温建立反应体系
    • DpnI 降低背景，模板起始量浓度范围更广
    • 使用常规引物避免了磷酸化或纯化寡核苷酸的额外费用
    • 易于使用的 PCR 预混液和独特的多酶 KLD 混合液更加方便，质量更高
    • 在室温条件下，五分钟内即可完成快速直接的处理步骤

  • 相关产品

    相关产品

    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • SOC Outgrowth 培养基
    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 贮存说明：
      Q5 定点突变试剂盒在 –80℃ 可保存一年。为方便起见，Q5 热启动超保真 2X 预混液、KLD 酶混合液、KLD 反应缓冲液、对照引物和模板 DNA 一起包装在一个单独的盒子中；各组份可取出并贮存于 –20℃ 两年，不会损失任何活性。可以取出 SOC 并贮存在室温下。NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞必须贮存于 –80℃，并避免反复冻融。

  • 参考文献

    1. Kalnins et al., (1983). The EMBO Journal. 2, 593-597.
    2. Dickinson DJ, Ward JD, Reiner DJ, Goldstein B. (2013). Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.. Nat Methods. Sep 1, PubMedID: 23995389

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Quick Protocol for Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (E0554)
    2. Protocol for Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (E0554)
    3. Protocol for Control Reaction (E0554)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE0554

  • 应用实例

    • Improved methods for site-directed mutagenesis using NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix

工具 & 资源

  • Web 工具

    • NEBaseChanger

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How do I design primers to use with the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    2. What should I use for an annealing temperature with the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    3. Do I need to purify my plasmid before or after the KLD reaction when using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    4. What plasmid sizes can be amplified using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    5. What is the maximum number of nucleotides that can be inserted with this kit?
    6. What is the maximum distance that can be tolerated between substitutions?
    7. Typically, what percentage of transformants will have the desired mutation incorporated?
    8. What is the KLD Mix?
    9. Can I use my own competent cells?
    10. If I double my PCR size, should I add more PCR mix to the KLD reaction?
    11. Why is the desired mutation missing from the transformants that I screened?
    12. Why do I not see my PCR product after using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    13. I use the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit to introduce single mutations. How can I introduce multiple mutations?

  • 问题解决指南

    • 确保引物设计正确。除引入缺失外，设计的两条引物的 5´ 末端应背靠背对齐，以利于进行指数扩增（见图 3）。为得到最佳结果，推荐使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 设计引物并计算退火温度。
    • 取 2–5 μl 反应体系在琼脂糖凝胶上观察，确保 PCR 产物单一。对于低纯度或不纯的 PCR 产物，请按照以下建议操作。
    • KLD 反应液中仅使用 1 μl PCR 产物。使用过多 PCR 产物可能会降低转化效率。如果 PCR 产量过低，可将更多产物添加到 KLD 反应液中，但必须在转化之前进行纯化，例如 PCR 纯化。
    • 转化时仅使用 5 μl KLD 反应液。如果添加更多 KLD 反应液，则应在转化之前进行纯化，例如 PCR 纯化。
    • 确保质粒中的选择性 DNA Marker 与平板中使用的筛选剂相匹配
    • 确保 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞贮存于 -80℃。
    • 检查感受态细胞的转化效率是否约为 1 x 109 cfu/μg。为了计算转化效率，将 2 μl 对照 pUC19 DNA（100 pg）转化到 50 μl 细胞。按照第 8 页的转化操作流程进行转化。涂板前，将 10 μl 细胞在 SOC 中稀释至 1 ml。取 100 μl 稀释液涂板。在本例中，150 个菌落的转化效率将为 1.5 x 109 cfu/μg
      （μg DNA = 0.0001，稀释度 = 10/1000 x 100/1000）。

    没有 PCR 产物或产物很少

    • 确保使用最佳退火温度（Ta）。高保真聚合酶适合 Tm+3 退火温度。使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 计算 Ta。另外，可以使用梯度 PCR 和琼脂糖凝胶分析来确定最佳退火温度。
    • 确保延伸时间与质粒长度相匹配。建议每 kb 质粒延伸时间为 20–30 秒。
    • 确保每个引物的终浓度为 0.5 μm。
    • 用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化引物。

    得到的质粒不包含所需的突变

    • 确保正确设计突变引物。
    • 优化 PCR 条件（见上文）。
    • 在 PCR 步骤中使用 1–25 ng 模板。如果使用少于 1 ng 或多于 25 ng 的模板，则会小幅增加未引入/不正确突变的克隆数量。

  • 实验技巧

    1. 如果得到的质粒不包含所需的突变（野生型序列），建议在 PCR 步骤中使用 ≤ 10 ng 的模板。另外，也可将 KLD 温育时间延长至 30-60 分钟来减少野生型质粒的背景。

    2. 如果没有菌落或菌落很少，请确保引物设计正确。除引入缺失外，设计的两条引物的 5´ 末端应背靠背对齐，以利于进行指数扩增。为得到最佳结果，推荐使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 设计引物并计算退火温度。

    3. 如果没有 PCR 产物或产物很少，请确保使用了最佳退火温度（Ta）。高保真聚合酶适合 Tm+3 退火温度。使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 计算 Ta。另外，可以使用梯度 PCR 和琼脂糖凝胶分析来确定最佳退火温度。

Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

Q5 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）可以在 2 小时内快速对双链质粒 DNA 进行定点突变（图 1）。该试剂盒使用稳定的 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶，结合客户自行设计的引物，在各种质粒中引入插入、缺失和替换突变。PCR 后将扩增材料直接添加到独特的激酶-连接酶-DpnI（KLD）酶混合液中，进行快速室温环化和模板去除（5 分钟）（图 2）。 将质粒转化到高效级 E. coli 感受态细胞（不随试剂盒提供），以确保转化长度至少为 20 kb 的质粒能获得稳定的结果。也提供含感受态细胞的试剂盒（NEB #E0554）

图 1：2 小时内完成定点突变。Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞） |
使用预混液、独特的多酶 KLD 酶混合液和快速聚合酶可确保大多数质粒的突变反应在两小时内完成。

Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞） |    

图 2：Q5 定点突变概览。Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞） |
此试剂盒经优化设计，可快速有效地将插入、缺失和替换引入双链质粒 DNA。第一步是使用常规引物和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶的预混液进行指数扩增。第二步是使用含有激酶、连接酶和 DpnI 的独特酶混合液一起温育。在这些酶的共同作用下，可实现 PCR 产物快速环化，并去除模板 DNA。最后一步是转化到高效级化学感受态细胞（不随试剂盒提供）。
图 3：Q5 定点突变试剂盒引物设计Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞） |
使用专门设计的正向（黑色）和反向（红色）引物，将替换、缺失和插入引入质粒 DNA。与依赖线性扩增的试剂盒不同，为 Q5 定点突变试剂盒设计的引物不会重叠，从而可以确保实现指数扩增的优势。A）通过在正向引物的中间引入所需更换的核苷酸（* 表示）来产生替换，在突变的 3´ 侧应包含至少 10 个互补核苷酸序列。设计的反向引物应让两条引物的 5´ 末端背靠背退火。B）通过对删除区域两侧设计标准的、非突变正向和反向引物，来进行缺失改造。C）将少于或等于 6 个核苷酸的插入引入正向引物的 5´ 末端，同时反向引物与正向引物的互补区域的 5´ 末端背靠背退火。D）可以通过将所需插入序列的一半引入两条引物的 5´ 末端以实现更大片段的插入。插入片段的大小上限很大程度上取决于寡核苷酸合成的限制。
图 4：NEB Q5 SDM 试剂盒比 Agilent QuikChange® SDM 试剂盒的转化效率更高
Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞） |
图中显示了使用背靠背对照 SDM 引物混合液和对照 SDM 质粒（6.7 kb）进行的替换反应（4 nt）的结果，以及 12 nt 缺失实验（5.8 kb 质粒）和 18 nt 插入实验（7.0 kb 质粒）的结果。在这三种实验中，得到菌落的预期突变效率在 90% 以上。如果细胞在涂板前未稀释，则将结果标准化为转化子总数。为了进行比较，使用 QuikChange Lightning 定点突变试剂盒（Agilent）按照 Agilent 操作流程进行相同的替换反应（4 nt），并使用 Agilent 引物设计工具设计重叠引物。

*请注意，QuikChange 试剂盒不适用于这种大小的缺失和插入，因此无法对这些实验进行比较。

产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
Site Directed Mutagenesis,
Site Directed Mutagenesis

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E0552S     -20    
        KLD Reaction Buffer B0554AVIAL -20 1 x 0.15 ml 2 X
        Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix M0494AVIAL -20 1 x 0.125 ml 2 X
        Control SDM Plasmid N0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 5 µg/ml
        Control SDM Primer Mix S0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 10 µM
        KLD Enzyme Mix M0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 10 X

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • E. coli 化学感受态细胞
    • SOC Outgrowth 培养基
    • 筛选平板

  • 优势和特性

    Features

    • 非重叠的引物设计保证高效的指数扩增，并从多种模板中产生高百分比的期望突变
    • 分子内连接及转化到 NEB 高效级感受态细胞可得到较多菌落
    • Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶错配率极低，可缩短筛选时间
    • 热启动聚合酶可实现室温建立反应体系
    • DpnI 降低背景，模板起始量浓度范围更广
    • 使用常规引物避免了磷酸化或纯化寡核苷酸的额外费用
    • 易于使用的 PCR 预混液和独特的多酶 KLD 混合液更加方便，质量更高
    • 在室温条件下，五分钟内即可完成快速直接的处理步骤
    • 允许使用任何适用于克隆的 E. coli 化学感受态细胞

  • 相关产品

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    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
    • Q5® 定点突变试剂盒
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • SOC Outgrowth 培养基
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 贮存说明：
      Q5 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）于 –20℃ 可稳定贮存两年。突变试剂和对照反应不含感受态细胞，任何适用于克隆的 E. coli 化学感受态细胞都可以使用，极大的增加了灵活性。

  • 参考文献

    1. Kalnins et al. (1983). The EMBO Journal. 2, 593-597.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Quick Protocol for Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (Without Competent Cells) Quick (E0552)
    2. Protocol for Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (Without Competent Cells) (E0552)
    3. Protocol for Control Reaction (E0552)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE0552

工具 & 资源

  • Web 工具

    • NEBaseChanger
    • NEBcloner®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the maximum number of nucleotides that can be inserted with this kit?
    2. What is the maximum distance that can be tolerated between substitutions?
    3. Typically, what percentage of transformants will have the desired mutation incorporated?
    4. What is the KLD Mix?
    5. What types of competent cells are compatible with this kit?
    6. If I double my PCR size, should I add more PCR mix to the KLD reaction?
    7. Why is the desired mutation missing from the transformants that I screened?
    8. Why do I not see my PCR product after using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    9. What plasmid sizes can be amplified using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    10. Do I need to purify my plasmid before or after the KLD reaction when using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    11. How do I design primers to use with the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    12. What should I use for an annealing temperature with the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    13. I use the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit to introduce single mutations. How can I introduce multiple mutations?

  • 问题解决指南


    没有菌落或菌落很少

    • 确保使用高效级 E. coli 化学感受态细胞。经证明，以下 E. coli感受态细胞可与此试剂盒配合使用：
      NEB #C2987，NEB 5-alpha（高效级）（标准推荐）
      NEB #C2992，NEB 5-alpha F´Iq（高效级）
      NEB #C3019，NEB 10-beta（高效级）
      NEB #C2984，NEB Turbo
      NEB #C2566，T7 Express
      NEB #C3029，Shuffle® T7

      方便起见，我们也提供含有感受态细胞的 Q5 定点突变试剂盒，内含
      NEB #C2987 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级），货号为 NEB #E0554。

      可以代替其它适用于克隆的 E. coli 化学感受态细胞。结果因感受态细胞的质量和效率而异。

    • 检查感受态细胞的转化效率是否约为 1 x 109  cfu/μg。为了计算转化效率，将 2 μl pUC19 DNA（NEB #N3041）（100 pg）转化到 50 μl 细胞。按照第 8 页的转化操作流程进行转化。涂板前，将 10 μl 细胞在 SOC 中稀释至 1 ml。取 100 µl 稀释液涂板。在本例中，150 个菌落的转化效率将为 1.5 x 109 cfu/μg （μg DNA = 0.0001，稀释度 = 10/1000 x 100/1000）。
    • 确保引物设计正确。为了利用扩增反应的指数性质，除非产生缺失，否则两条引物的 5´ 末端应背靠背对齐（见图 3）。为得到最佳结果，推荐使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger 设计引物并计算退火温度。
    • 取 2-5 μl 反应体系在琼脂糖凝胶上观察，确保 PCR 产物单一。对于低纯度或不纯的 PCR 产物，请按照以下建议操作。
    • KLD 反应液中仅使用 1 μl PCR 产物。使用过多 PCR 产物可能会降低转化效率。如果 PCR 产量过低，可将更多产物添加到 KLD 反应液中，但必须在转化之前进行纯化，例如 PCR 纯化。
    • 转化时仅使用 5 μl KLD 反应液。如果添加更多 KLD 反应液，则应在转化之前进行纯化，例如 PCR 纯化。
    • 确保质粒中的选择性 DNA Marker 与平板中使用的筛选剂相匹配
    • 确保 E. coli 细胞贮存于 –80℃。

    没有 PCR 产物或产物很少

    • 确保使用最佳退火温度（Ta）。高保真聚合酶适合 Tm+3 退火温度。使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger 计算 Ta。另外，可以使用梯度 PCR 和琼脂糖凝胶分析来确定最佳退火温度。
    • 确保延伸时间与质粒长度相匹配。建议每 kb 质粒延伸时间为 20-30 秒。
    • 确保每个引物的终浓度为 0.5 μm。
    • 用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化引物。

    得到的质粒不包含所需的突变

    • 确保正确设计突变引物。
    • 优化 PCR 条件（见上文）。
    • 在 PCR 步骤中使用 1-25 ng 模板。如果使用少于 1 ng 或多于 25 ng 的模板，则会小幅增加未引入/不正确突变的克隆数量。

  • 实验技巧

    1. 如果得到的质粒不包含所需的突变（野生型序列），建议在 PCR 步骤中使用 ≤ 10 ng 的模板。另外，也可将 KLD 温育时间延长至 30-60 分钟来减少野生型质粒的背景。

    2. 如果没有菌落或菌落很少，请确保引物设计正确。除引入缺失外，设计的两条引物的 5´ 末端应背靠背对齐，以利于进行指数扩增。为得到最佳结果，推荐使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 设计引物并计算退火温度。

    3. 如果没有 PCR 产物或产物很少，请确保使用了最佳退火温度（Ta）。高保真聚合酶适合 Tm+3 退火温度。使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 计算 Ta。另外，可以使用梯度 PCR 和琼脂糖凝胶分析来确定最佳退火温度。

Next® Q5® 热启动超保真 PCR 预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Next® Q5® 热启动超保真 PCR 预混液 |

Next® Q5® 热启动超保真 PCR 预混液 |
 

NEBNext® Q5 热启动超保真 PCR 预混液是独创的 Q5 DNA 聚合酶热启动 NEBNext 剂型。在所有的 NEBNext Ultra 试剂盒中，均含有此剂型，用于 DNA 和 RNA 文库制备。

NEBNext Ultra II Q5 预混液（NEB #M0544）现已商售，它能够进一步提高文库扩增的一致性，即使在 GC 富集区域依然表现优异。

这两种预混液中均含有 Q5 超保真 DNA 聚合酶，它是一种具备热稳定性的新型 DNA 聚合酶，具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，并且融合了具有增强持续合成能力的 Sso7d 结构域。Q5 还具有最优异的保真度（比 Taq DNA 聚合酶高 280 倍），错配率极低。

这款便捷的 2X 预混液包含 dNTP、Mg++ 以及专有缓冲液，仅需加入引物和 DNA 模板，即可稳健扩增。加入热启动适配体后，可以更方便地在室温下建立反应体系。

覆盖深度与未扩增文库的相关性
Next® Q5® 热启动超保真 PCR 预混液 |
使用 NEBNext Q5 热启动超保真 PCR 预混液进行文库扩增来对扩增的均一性进行评价。Y 轴表示以 hg19 为参考基因组，每 10 kb 的平均覆盖深度；X 轴表示 PCR-Free 文库的 reads 数。使用 NEBNext Ultra DNA 文库制备试剂盒（NEB #E7370）制备文库，并在 HiSeq® 2500 上进行测序，测序结果以 hg19 为参考基因组进行比对（Bowtie 2.1.0）、重复标记（Picard 1.56）以及向下抽样至 420M reads（Picard 1.56）。使用 Bedtools（2.19.1）统计 hg19 每个 10 kb 区间上的 reads，再将碱基 reads 除以间隔长度（10 kb）来计算平均覆盖度。
NEBNext Q5 热启动超保真 PCR 预混液可将 GC 偏好性降至最低
Next® Q5® 热启动超保真 PCR 预混液 |
未经 PCR 扩增的人类（IMR-90）或大肠杆菌 K12 基因组 DNA 文库和使用 NEBNext Q5 热启动超保真 PCR 预混液进行扩增的相应文库，同时在 Illumina MiSeq® 上测序。GC 偏差图已生成，X 轴为每 100 bp 的 GC 含量（%）。标准化后的覆盖度由蓝色圆圈表示，参考序列的 GC 含量（%）由红线表示，碱基质量由绿线表示。与 PCR-free 文库相比，使用 NEBNext 热启动超保真 PCR 预混液扩增的文库中也可以观察到类似的 GC 偏差。

反应条件
NEBNext Q5 热启动超保真PCR 预混液、DNA 模板和 0.5 μM 到 1.25 μM 的引物（视样品加入量而定），总反应体积为 50 μl。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带 Q5 DNA 聚合酶基因。

产品类别:
Q5® High-Fidelity DNA Polymerases Products,
Master Mixes Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

应用:
Polymerases for NGS Library Preparation,
Hot Start PCR,
Fast PCR,

Specialty PCR,
Routine PCR,
DNA Amplification, PCR & qPCR,

PCR

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0543S     -20    
        NEBNext® Q5® Hot Start HiFi PCR Master Mix M0543SVIAL -20 1 x 1.25 ml Not Applicable
    • M0543L     -20    
        NEBNext® Q5® Hot Start HiFi PCR Master Mix M0543SVIAL -20 5 x 1.25 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    热失活

    否

  • 优势和特性

    应用特性

    • 二代测序文库扩增
    • 超保真 PCR
    • 难扩增片段
    • 高通量 PCR

  • 相关产品

    相关产品

    • NEBNext® Ultra 连接模块
    • NEBNext® 多样本接头引物试剂盒 1（12 种单端 Index 引物）
    • NEBNext® 多样本接头引物试剂盒 2（12 种单端 Index 引物）
    • NEBNext® 多样本接头引物试剂盒 1（8 x 12 种双端 Index 引物）
    • NEBNext 多样本接头引物试剂盒 3（12 种单端 Index 引物）
    • NEBNext® 多样本接头引物试剂盒 4（12 种单端 Index 引物）
    • NEBNext® 多样本接头引物试剂盒（96 种单端 Index 引物）

  • 注意事项

    1. To ensure optimal performance, themaster mix should be thawed and resuspendedprior to use. Stability testing using up to 30 freeze/thaw cycles has shown no negative effect onmaster mix performance. The NEBNext Q5 HotStart HiFi PCR Master Mix may be liquid at –20°C.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for a PCR reaction using NEBNext® Q5® Hot Start HiFi PCR Master Mix (M0543)

工具 & 资源

  • Web 工具

    • Tm Calculator

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What’s New About NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix?
    2. What types of beads can be used with NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix?
    3. Is NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix the same as the Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (M0494)?
    4. Is NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix the same as NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix (M0541)?
    5. Is NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix the same as NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix (M0541), or Q5 Hot Start High-Fidelity 2X PCR Master Mix (M0494)?
    6. Do I need to make any changes to the cycling conditions for my NGS library amplification I have previously been using with Phusion High-Fidelity PCR Master Mix?
    7. How many cycles of PCR should I perform with NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix?
    8. Are the DNA products produced by NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix blunt-ended or do they have a single base 3’ overhang?
    9. What do I do if I see precipitation in the NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix?
    10. What are the advantages of using NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix?
    11. Will NEBNext® Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix incorporate dUTPs?