EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes |

EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 提供一种简单、快速的方法， 用户可以使用随附的试剂和自己设计的靶标特异 DNA 寡核苷酸在单次反应中转录大量 sgRNA， 反应用时仅需 30 分钟。

自然界中，S. pyogenes Cas9 的启动与 2 种 RNA 有关（crRNA 和 tracrRNA）。crRNA 又称 CRISPR RNA，包含大约 20 个核苷酸，位于 PAM（Protospacer Adjacent Motif）NGG 序列的上游，与目标 DNA 反义链同源互补。tracrRNA 又称 transactivating crRNA，tracrRNA 序列的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构可被 Cas9 识别。在实际操作中，将 tracrRNA 和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链引导 RNA（sgRNA）（1）,并与 Cas 9 形成复合体，识别并切割目标 DNA。

在 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 的 EnGen 2X sgRNA 反应混合液中，含有能被 S. pyogenes Cas 9 识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。对这两种寡核苷酸的重叠区域进行退火，然后使用 DNA 聚合酶进行填充，形成用于转录的双链 DNA（dsDNA）模板。双链 DNA 模板的合成和 RNA 转录在一个反应中完成，生成具有功能的 sgRNA。

1.    Jinek, M. et al. （2012）Science816 – 821 PubMed ID：22745249。

图 1：EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 的实验流程。

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图 2：EnGen sgRNA 合成试剂盒概览

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A. 特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子、~20 nt 目标特异性序列及与 S. pyogenes Cas9 识别支架序列互补的 14 nt 重叠区域（反应混合液中提供）。室温下，混合特异性目标链（或 EnGen sgRNA 调控序列）与 EnGen 2X sgRNA 反应预混液（NTPs、dNTPs、S. pyogenes Cas9 识别支架序列）及 EnGen sgRNA 酶预混液（DNA 和 RNA 聚合酶）。B. 在 37℃ 条件下，具有 14 nt 互补重叠区域的 2 个片段发生退火。C. DNA 聚合酶从 3´ 端开始延伸，形成一个双链 DNA 模板。D. RNA 聚合酶识别 T7 启动子及其下游的双链 DNA 并开始转录。最终形成的 sgRNA 包含目标特异片段、crRNA 和 tracrRNA。37℃ 条件下，单管反应 30 分钟即可完成所有步骤。 

图 3：使用 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 和几种不同的靶标特异性寡核苷酸（包括 EnGen sgRNA 对照寡核苷酸，S. pyogenes）合成的 sgRNA 示例。
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RNA 在变性条件下用 10% Novex TBE-Urea 电泳胶检测，并使用 SYBR Gold 进行后染色。
图 4：合成 RNA 与体外转录 RNA 对比
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使用 Lonza SF 细胞系 4D-Nucleofector™ 试剂盒对 293T 细胞进行电穿孔。48 小时后，用 Epicentre QuickExtract™ 提取 DNA。使用 EnGen 突变检测试剂盒（NEB #E3321S）确定修饰百分比
产品类别:
sgRNA Synthesis Reagents and Kits Products,
Genome Editing Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3322V     -20    
        EnGen® sgRNA Enzyme Mix M3322AVIAL -20 1 x 0.04 ml Not Applicable
        EnGen® 2X sgRNA Reaction Mix, S. pyogenes N3320SVIAL -20 1 x 0.1 ml Not Applicable
        DNase I (RNase-free) M0303AAVIAL -20 1 x 0.04 ml 2,000 units/ml
        EnGen® sgRNA Control Oligo, S. pyogenes S3321AVIAL -20 1 x 0.02 ml 1 µM
        Dithiothreitol (DTT) B1222AVIAL -20 1 x 0.5 ml 100 mM
    • E3322S     -20    
        EnGen® sgRNA Enzyme Mix M3322AVIAL -20 1 x 0.04 ml Not Applicable
        EnGen® 2X sgRNA Reaction Mix, S. pyogenes N3320AVIAL -20 1 x 0.2 ml Not Applicable
        DNase I (RNase-free) M0303AAVIAL -20 1 x 0.04 ml 2,000 units/ml
        EnGen® sgRNA Control Oligo, S. pyogenes S3321AVIAL -20 1 x 0.02 ml 1 µM
        Dithiothreitol (DTT) B1222AVIAL -20 1 x 0.5 ml 100 mM

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    靶标特异性 DNA 寡核苷酸
    热循环仪/37℃ 加热块/温育器
    无核酸酶水
    RNA 定量设备和试剂
    RNA 纯化离心柱（如 NEB #T2040）
    无 RNase 管、防气溶胶吸头
    微型离心机

    可选材料：
    小牛肠碱性磷酸酶（CIP）
    Spy Cas9 核酸酶
    EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶
    电泳胶、电泳缓冲液、凝胶上样染料、RNA 和 DNA Ladder、凝胶盒

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    • EnGen® 突变检测试剂盒
    • 低分子量 ssRNA Ladder
    • 2X RNA 上样染料
    • 6X 紫色凝胶上样染料
    • 1 kb Plus DNA Ladder
    • T2040 Monarch RNA Cleanup Kit 50 ug

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. EnGen® sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes Protocol (NEB #E3322)
    2. Transfection of Cas9 RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3322

工具 & 资源

  • Web 工具

    • EnGen sgRNA Template Oligo Designer

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. The sgRNA is not running as a single band on the gel – why is this happening?
    2. Is it necessary to add a “G” into the oligo following the T7 promoter sequence?
    3. Is it necessary to DNase treat my sgRNA synthesis reaction?
    4. Why is my sgRNA not exhibiting 100% in vitro Cas9 cleavage activity?
    5. Is it necessary to phosphatase treat my sgRNAs?
    6. The sgRNA is not running as a single band on the gel – why is this happening?
    7. Will the sgRNAs synthesized from this kit (NEB #E3322S) be recognized by homologs of Cas9 from different organisms?
    8. Do I include the PAM(NGG) in my sgRNA sequence?
    9. What is the sequence of the control oligo provided with the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes?
    10. Is the Monarch RNA Cleanup Kit (NEB #T2040) compatible with the EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes?
    11. Is it necessary to add the provided DTT to the sgRNA synthesis reaction?