EnGen® Spy Cas9 NLS 核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶是一种 RNA 介导的核酸内切酶，可催化双链 DNA 的位点特异性切割。该酶可识别 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列（1）的 NGG 处，并在靶标序列的 3 个碱基内进行切割。PAM 序列的 NGG 必须连在基因编辑靶标位点之后，位于与 sgRNA 序列互补的 DNA 的链上。EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

使用 Cas9 RNP 复合物注射方法提高了基因组编辑效率

EnGen® Spy Cas9 NLS 核酸酶 |
将打靶特定人源基因的 Cas9 和 sgRNA 转染到 HEK293 细胞。转染所用的质粒 DNA 上含有表达带双端（N 端和 C 端）核定位序列（NLS）的 Cas9 及 sgRNA 的表达框。通过 TransIT-X2（Mirus）转染试剂进行转染。转染所用的 Cas9 mRNA 进行了假尿苷和 5- 甲基胞嘧啶修饰且带有双端（N 端和 C 端）核定位序列（NLS），使用 TransIT-mRNA 转染试剂将 sgRNA 和 mRNA 共转染。Cas9 RNPs 使用脂质体 RNAiMAX（Life Technologies）进行反向转染，RNP 的终浓度为 10 nmol。Cas9 的蛋白序列中不含核定位序列（NLS）。EnGen Cas9 核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有核定位序列。编辑效率通过 T7 核酸内切酶 I 实验进行分析，结果以修饰百分比进行统计。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 基因，在其编码蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）核定位序列（NLS），N 端同时带有 6xHis 标签。

产品类别:
Genome Editing Products,
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0646T     -20    
        EnGen® Spy Cas9 NLS M0646TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0646M     -20    
        EnGen® Spy Cas9 NLS M0646MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 μM 等于 3.22 mg/ml

  • 参考文献

    1. Jinek M. et al. (2012). Science. 816-821. DOI: 10.1126/Science.1225829. Epub 2012 Jun 28 PubMedID: 22745249,

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of DNA with EnGen Spy Cas9 NLS (M0646)
    2. Protocol for Electroporation of EnGen® SpyCas9 NLS, S. pyogenes RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lonza 4D-Nucleofector™ System
    3. Transfection of Cas9 RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX
    4. Electroporation of EnGen® Spy Cas9 NLS RNP (ribonucleoprotein) into adherent cells using the Neon® Electroporation System
    5. In vitro digestion of plasmid DNA with EnGen SpRY Cas9 (NEB #M0669)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where is the nuclear localization signal on EnGen® Spy Cas9 NLS located?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Spy Cas9 NLS?
    3. What is the difference between EnGen® Spy Cas9 NLS (NEB #M0646) and Cas9 NLS, S.pyogenes (NEB #M0641)?
    4. Why do I observe incomplete digestion?
    5. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    6. Does NEB provide plasmids for gRNA cloning?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?