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EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒可以选择性地结合和富集片段化的基因组 DNA 中的双链甲基化 CpG DNA，DNA 起始样本量可低至 5 ng。

此试剂盒通过人 MBD2 蛋白的甲基化 CpG 结合域将甲基化 DNA 从片段化基因组 DNA (5 ng–25 μg) 中分离出来，其中，人 MBD2 蛋白融合了人 IgG1 抗体的 Fc 尾部（MBD2-Fc）并偶联顺磁性 Protein A 磁珠（MBC2-Fc/Protein A 磁珠）。Protein A 上的一个位点可高亲和力地结合两个 Fc 结构域（Kd=10-7）。由于 Fc 片段是二聚体，因此在溶剂中，每个 Protein A 分子有四个暴露的 MBD2 结构域结合位点，从而将相对平衡常数提高了 100 倍。这种稳定的复合物可以选择性地结合含甲基化 CpG 的双链 DNA。经过简单漂洗和磁性捕获步骤之后，富集的 DNA 样本可以在 65℃ 下很容易地在少量无核酸酶水中温育洗脱，并且可随即对样本进行下游分析。下游分析方法有多种，包括：

  • 终点和实时 PCR 测定
  • 重亚硫酸盐转化后进行 DNA 扩增
  • 克隆和测序
  • 直接测序
  • 高通量测序文库制备
  • 针对 DNA 微阵列分析进行标记
  • 基于甲基化敏感限制性内切酶的测定

MBD-Fc 和 MCIp 最初由雷根斯堡大学的 Michael Rehli 开发，用于提高传统 CpG 结合技术的敏感性和特异性。

试剂盒组分： 

每个试剂盒包含的试剂足以从最高 100 μg 片段化的起始 DNA 中富集甲基化 DNA。如果每次实验的 DNA 起始样本量为 5 ng 到 10 μg，则此试剂盒提供的试剂足以用于 25 次反应。贮存温度为 4℃。如果存放时间超过 6 个月，则应将 MBD2-Fc 蛋白存放在 -20℃ 温度以下。

 

图 1：富集流程

EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒 | 

图 2：对使用 EpiMark 甲基化 DNA 富集试剂盒纯化的样本进行甲基化位点的终点 PCR 分析（LINE）。

EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒 | 

已分析的样本显示在胶图上方。
产品类别:
Methylome Analysis Products,
Epigenetic Analysis Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

应用:
DNA Enrichment

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E2600S     Multi-temperature    
        Bind/Wash Reaction Buffer (5X) B1032AVIAL 4 2 x 25 ml 5 X
        NaCl High-Salt Elution Buffer (2M) B1033AVIAL 4 1 x 15 ml Not Applicable
        Fragmented HeLa DNA N0484AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µg/ml
        LINE Primers for Methylated Controls N0485AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µM
        RPL30 Primers for Non-methylated Controls N0486AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µM
        MirA Primers for Input Control N0487AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µM
        MBD2a-Fc Protein M0358AVIAL -20 1 x 0.025 ml 2 mg/ml
        Protein A Magnetic Beads S1426AVIAL 4 1 x 0.25 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    50 bp DNA Ladder（NEB #N3236）
    6 孔磁性分离架（NEB #S1506）
    Taq DNA 聚合酶（提供标准 Taq 缓冲液）（NEB #M0273）
    脱氧核糖核苷酸混合溶液（NEB #N0447）
    无核酸酶水

  • 优势和特性

    Features

    • 高亲和性结合力带来更高灵敏度。
    • 减少洗脱液用量可简化下游实验。
    • 操作简便，样本富集时间不到 2 小时。
    • 已富集的甲基化 DNA 样本可轻松连接双链接头，以便进行二代测序。
    • 从不同浓度范围的 DNA 投入量可获得纯度高的产物。

  • 方法概述

    方法概述

    第一步 — 片段化基因组 DNA
    必须采用超声处理、雾化或酶处理方式将 DNA 片段化为平均长度小于 1,000 bp。

    第二步 — 在 1X 结合/漂洗缓冲液中使 MBD2-Fc 与 Protein A 磁珠结合。
    在室温下温育反应 15 分钟。在结合/漂洗反应缓冲液中漂洗磁珠两次。

    第三步 — 将片段化的 DNA 添加到 MBD2-Fc/Protein A 磁珠里。
    在室温下温育反应 20 分钟。在室温下漂洗磁珠三次，每次漂洗五分钟，去掉未结合的 DNA。

    第四步 — 将富集的甲基化 CpG DNA 从磁珠上洗脱
    在 65℃ 温度下，在无 DNase 的水中温育样本 15 分钟。
     

    图 1：富集流程

     

    图 2：对使用 EpiMark 甲基化 DNA 富集试剂盒纯化的样本进行甲基化位点的终点 PCR 分析（LINE）。

    已分析的样本显示在胶图上方。

  • 相关产品

    相关产品

    • Taq DNA 聚合酶（提供标准 Taq 缓冲液）
    • 50 bp DNA Ladder
    • 6 孔磁性分离架
    • Deoxynucleotide Solution Mix

  • 参考文献

    1. Cross, S.H., Charlton, J.A., Nan, X., and Bird, A.P. (1994). Nat. Genet. . 6, 236-244.
    2. Fraga, M.F. et al. (2003). Nucleic Acids Res.. 31, 1765-1774.
    3. Gebhard, C. et al. (2006). Nucleic Acids Res. . 34, e82.
    4. Gebhard, C. et al. (2006). Cancer Research . 66, 6118-6128.
    5. Jacinto, F.V., Ballestar, E. and Esteller, M. (2008). Biotechniques . 44, 35, 37, 39 passim.
    6. Lister, R. et al. (2008). Cell. 133, 523-536.
    7. Rauch, T. and Pfeifer, G.P. (2005). Lab Invest.. 85, 1172-1180.
    8. Schilling, E. and Rehli, M. (2007). Genomics . 90, 314-323.
    9. Weber, M. et al. (2005). Nat. Genet. . 37, 853-862.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. DNA Fragmentation (E2600)
    2. Prebind MBD2a-Fc to Protein A Magnetic Beads (NEB #E2600)
    3. Capture Methylated CpG DNA (E2600)
    4. Wash Off Unbound DNA (E2600)
    5. Elute Captured Methylated CpG DNA (E2600)
    6. Capture and Elute Step for Control DNA (E2600)
    7. Downstream Analysis (NEB #E2600)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE2600

FAQs & 问题解决指南

  • 问题解决指南

    • EpiMark® Methylated DNA Enrichment Kit Troubleshooting Guide

EpiMark® 热启动 Taq DNA 聚合酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EpiMark 热启动 Taq DNA 聚合酶是 Taq DNA 聚合酶和温度敏感性核酸适配体抑制剂的混合物。这种抑制剂可与酶可逆结合，在温度低于 45℃ 时抑制聚合酶活性，而在正常的 PCR 循环条件下释放酶。此特性有助于在室温下建立反应体系。基于适配体的热启动机制的一个优点是无需单独的高温温育步骤来激活酶。EpiMark 热启动 Taq DNA 聚合酶拥有先进的基于适配体的热启动机制活性，并随附经优化的反应缓冲液，堪称用于扩增重亚硫酸盐转化 DNA 的理想之选。

Taq DNA 聚合酶具有 5´ – 3´ 聚合酶活性（1、2、3）和 5´ 结构特异性核酸内切酶活性（4、5）。

EpiMark 热启动 Taq DNA 聚合酶随附 5X EpiMark 热启动 Taq 反应缓冲液，从而可实现重亚硫酸盐转化 DNA 和富含 AT 的扩增子的稳定扩增。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有克隆自水生嗜热菌（Thermus aquaticus）YT-1 的 Taq DNA 聚合酶基因。

产品类别:
Methylome Analysis Products,
Epigenetic Analysis Products,
Taq DNA Polymerase Products,

Next Generation Sequencing Library Preparation Products

应用:
Bisulfite Sequencing,
Bisulfite Conversion,
Hot Start PCR,

Specialty PCR,
Routine PCR,

PCR

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0490S     -20    
        EpiMark® Hot Start Taq DNA Polymerase M0490SVIAL -20 1 x 0.025 ml 5,000 units/ml
        EpiMark® Hot Start Taq Reaction Buffer Pack B0490SVIAL -20 1 x 2 ml 5 X
    • M0490L     -20    
        EpiMark® Hot Start Taq DNA Polymerase M0490LVIAL -20 1 x 0.125 ml 5,000 units/ml
        EpiMark® Hot Start Taq Reaction Buffer Pack B0490SVIAL -20 3 x 2 ml 5 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位是指在 75℃ 条件下，30 分钟内将 15 nmol dNTP 掺入到酸不溶物所需的酶量。

    反应条件

    1X EpiMark®热启动 Taq 反应缓冲液套装

    1X EpiMark®热启动 Taq 反应缓冲液套装
    20 mM Tris-HCl
    1.8 mM MgCl2
    22 mM KCl
    0.06% IGEPAL® CA-630
    0.05% Tween® 20
    22 mM NH4Cl
    (pH 8.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    100 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    0.5% Tween® 20
    0.5% IGEPAL® CA-630
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    否

    分子量

    理论上的: 94000 道尔顿

    5′ – 3′ 核酸外切酶

    Yes

    3′ – 5′ 核酸外切酶

    No

    产物末端

    • 3´ 单碱基突出末端

    单位活性检测条件

    1X ThermoPol® 反应缓冲液、200 µM dNTP（含 [3H]-dTTP）和 15 nM 已结合引物的 M13 DNA。

  • 优势和特性

    应用特性

    • 重亚硫酸盐转化 DNA 的 PCR 实验

  • 相关产品

    相关产品

    • MgCl2 溶液
    • dNTP 套装
    • EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒
    • dNTP 混合液

    单独销售的组分

    • EpiMark® Hot Start Taq Reaction Buffer Pack

  • 参考文献

    1. Chien, A., Edgar, D.B. and Trela, J.M. (1976). J. Bact. . 127, 1550-1557.
    2. Kaledin, A.S., Slyusarenko, A.G. and Gorodetskii, S.I. (1980). Biokhimiya . 45, 644-651.
    3. Lawyer, F.C. et al. (1993). PCR Methods And Appl.. 2, 275-287.
    4. Longley, M.J., Bennett, S.E. and Mosbaugh D.W. (1990). Nucleic Acids Res. . 18, 7317-7322.
    5. Lyamichev, V., Brow, M.A. and Dahlberg, J.E. (1993). Science. 260, 778-783.
    6. Saiki R.K. et al. (1985). Science. 230, 1350-1354.
    7. Powell, L.M. et al. (1987). Cell. 50, 831-840.
    8. Sun, Y., Hegamyer, G. and Colburn, N. (1993). Biotechniques . 15, 372-374.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. EpiMark® Hot Start Taq DNA Polymerase Guidelines for PCR (M0490)

  • 使用指南

    • Activity of Restriction Enzymes in PCR Buffers

工具 & 资源

  • Web 工具

    • Tm Calculator

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What ends will my PCR products have?
    2. What are Hot Start and WarmStart® polymerases and when would I use them?
    3. How should I determine the appropriate annealing temperature for my reaction?
    4. My results are not as expected. Where can I find troubleshooting help?
    5. What should the final primer concentration be in my PCR?
    6. Is this Taq DNA Polymerase product compatible with other NEB Buffers?
    7. What are the general recommendations for designing primers for bisulfite-treated/deaminated DNA?

EpiMark® N6-甲基腺嘌呤富集试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EpiMark N6-甲基腺嘌呤富集试剂盒含有 N6-甲基腺嘌呤（m6A）兔源单克隆抗体。该试剂盒包含两种对照 RNA：一种有 m6A 修饰（Gaussia 荧光素酶），一种没有 m6A 修饰（Cypridina 荧光素酶），用于监测富集和去除程度。GLuc RNA 对照在转录过程中掺入了 20% 的 m6ATP 和 80% 的 ATP。
该试剂盒可用于在免疫沉淀实验流程中富集经 m6A 修饰的 RNA，可用于 RNA 测序或 RT-qPCR 等下游分析。在片段化 RNA 样本中，经修饰的 RNA 可与 N6-甲基腺嘌呤抗体结合，从而被与抗体结合的 Protein G 磁珠富集。经过多轮洗涤和纯化步骤后，富集的 RNA 洗脱于无核酸酶水中，可用于进一步分析。

EpiMark® N6-甲基腺嘌呤富集试剂盒 |
图 1：实验流程

当起始量最多为 250 µg 去除核糖体的 RNA 或富集的 Poly A+ RNA 时，每个试剂盒包含的试剂足以进行 10 x 2 轮免疫沉淀。当起始量最多为 250 µg 总 RNA 时，试剂盒包含的试剂足以进行 5 x 2 轮免疫沉淀。

产品类别:
Methylome Analysis Products,
RNA Modification,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1610S     -20    
        N6-Methyladenosine Antibody E1611AVIAL -20 1 x 0.02 ml 20 reactions
        m6A Control RNA N1611AVIAL -20 1 x 0.02 ml 100 nM
        Unmodified Control RNA N1612AVIAL -20 1 x 0.02 ml 100 nM

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    反应缓冲液
    （150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1% NP-40，溶于无核酸酶水）

    低盐反应缓冲液
    （50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1% NP-40，溶于无核酸酶水）

    高盐反应缓冲液
    （500 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1% NP-40，溶于无核酸酶水）

    Protein G 磁珠（NEB #S1430）

    用于磁珠分离的磁力架（NEB #S1506 或 #S1509）

    Dynabeads® MyOne™ Silane（Life Technologies #37002D）

    Buffer RLT（Qiagen #79216）

    100% 乙醇

    70% 乙醇

    Eppendorf® RNA/DNA LoBind 微量离心管（Sigma catalog #Z666548）或同等产品

    无 RNase 移液枪吸头

    无粉手套

    无核酸酶水

    可选材料
    对照 RNA 扩增用引物：
    GLuc 正向引物 = 5´- CGACATTCCTGAGATTCCTGG – 3´
    GLuc 反向引物 = 5´- TTGAGCAGGTCAGAACACTG – 3´
    CLuc 正向引物 = 5´- GCTTCAACATCACCGTCATTG – 3´
    CLuc 反向引物 = 5´- CACAGAGGCCAGAGATCATTC – 3´

    ProtoScript® II cDNA 第一链合成试剂盒（NEB #E6560）

    Bio-Rad iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix（#172-5120）

    384 孔 PCR 板（Bio-Rad #HSP-3805）
     
    光学封板膜（Bio-Rad #MSB-1001）

  • 相关产品

    相关产品

    • Protein G 磁珠
    • 6 孔磁性分离架
    • 12 孔磁性分离架
    • e6560-protoscript-ii-first-strand-cdna-synthesis-kit
    • NEBNext® RNA Mg++ 片段化模块

  • 参考文献

    1. Schwartz, S. et al. (2013). Cell. 155, 1409-1421. PubMedID: 24269006
    2. Slobodin, B. et al. (2017). Cell. 169, Issue 2, 326–337. PubMedID: 28388414,

操作说明、说明书 & 用法

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE1610

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How much of the control RNAs should I use if I want to spike them into my sample?
    2. Will the antibody bind m6A-containing DNA?
    3. What is the protein concentration of the N6-Methyladenosine Antibody?
    4. I did not get enough yield of RNA for my downstream application after two rounds of IP. How do I increase the yield?
    5. What method do you recommend for RNA fragmentation?

EpiMark® 5-hmC and 5-mC Analysis Kit |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

5-methylcytosine (5-mC) is the predominant epigenetic mark in mammalian genomic DNA. 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) is a newly discovered epigenetic modification that is presumably generated by oxidation of 5-mC by the TET family of cytosine oxygenases.1,2

Techniques exist that can identify 5-mC in genomic DNA, but the most commonly used method, bisulfite sequencing, is laborious and cannot distinguish between 5-mC from 5-hmC.3 

The kit distinguishes 5-mC from 5-hmC by the addition of glucose to the hydroxyl group of 5-hmC via an enzymatic reaction utilizing T4 β-glucosyltransferase (T4-BGT). When 5-hmC occurs in the context of CCGG, this modification converts a cleavable MspI site to a noncleavable one.

An overview of the detection procedure is summarized in Figure 1.

Control DNA Sequence 
5´-CAGTGAAGTTGGCAGACTGAGCCAGGTCCCACAGATGCAGTGACCGGAGT
CATTGCCAAACTCTGCAGGAGAGCAAGGGCTGTCTATAGGTGGCAAGTCA-3´

Control DNA substrates are synthetic 100 bp double stranded fragments containing a single MspI/HpaII site (CCGG). The three fragments are identical except for modification of the internal C in this site.

FW Primer Sequence 
5´- CA GTG AAG TTG GCA GAC TGA GC -3´

REV Primer Sequence 
5´- CTG ACT TGC CAC CTA TAG ACA GC -3´

产品类别:
Discontinued (<3 years)

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    Heat block or water bath (suitable for temperatures of 37°C, 40°C and 95°C) PCR materials:

    • Locus-specific primers, flanking a CCGG site of interest
    • DNA polymerase for PCR
    • Nucleotides for PCR
    • PCR Thermal Cycler (for endpoint experiments, option IIIa)
    • Real-time PCR cycler (for quantitative experiments, option IIIb)

    0.2 ml strip tubes and caps for PCR
    1.5 ml reaction tubes
    Molecular biology grade water

  • 方法概述

    方法概述

    Step I: DNA Glucosylation Reaction with T4 β-glucosyltransferase (T4-BGT) Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent – therefore all 5-hmC will be glucosylated, unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected.

    Step II: Restriction Endonuclease DigestionMspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation status. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI will recognize and cleave 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC.

    Step III: Interrogation of the Locus by PCR as little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100–200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction (see Figure 2). Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site.

    Figure 1a: Experimental Overview EpiMark® 5-hmC and 5-mC Analysis Kit |
    The DNA of interest is treated with T4 β-Glucosyltransferase (T4-BGT) and UDP-Glucose (UDP-Glc). T4-BGT transfers glucose from UDP-Glc onto 5-hydroxymethylcytosine (generating glucosylated 5-hydroxymethylcytosine [5-ghmC]). MspI cuts DNA containing 5-hmC, but does not cut 5-ghmC containing sites; in contrast, HpaII is blocked by any of these modifications. Presence of 5-hmC and 5-mC can be determined by PCR analysis.
    Figure 1b: Experimental OverviewEpiMark® 5-hmC and 5-mC Analysis Kit |
    The DNA of interest is digested following a control reaction with UDP-Glucose (UDP-Glc) and no T4 β-Glucosyltransferase (T4-BGT), leaving 5-hmC unmodified. MspI cleaves unmodified, 5-mC and 5-hmC DNA, while HpaII cleaves only unmodified DNA.
    Figure 2: Comparison of 5-hydroxymethylcytosine amounts at locus 12 in different mouse Balb/C tissue samples. (A) End-point PCR. (B) Real time PCR.EpiMark® 5-hmC and 5-mC Analysis Kit |
    DNA from four mouse tissues was analyzed. For comparative purposes, real time PCR data were normalized to uncut DNA. A standard curve was used to determine copy number. The samples could be normalized by dividing the copy number of samples No 1-6 by the copy number of the control that is undigested (No 5). Boxed gel lane shows variation in 5-hmC present.
    Figure 3: High sensitivity 5-hydroxymethylcytosine detection achieved by the EpiMark kit.EpiMark® 5-hmC and 5-mC Analysis Kit |
    100 bp unmodified, 5-mC, and 5-hmC control DNAs were mixed in different ratios (blue bars), and then measured with the EpiMark hydroxymethylated DNA detection kit (orange bars). Error bars represent the standard deviation of four independent experiments.

  • 相关产品

    相关产品

    • HpaII
    • MspI

    单独销售的组分

    • HpaII
    • MspI
    • NEBuffer 4
    • T4 噬菌体 β-葡糖基转移酶（T4-BGT）
    • p8107-proteinase-k-molecular-biology-grade

  • 参考文献

    1. Tahiliani, M., Koh, K.P., Shen, Y., Pastor, W.A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, (2009). Science 324. 930-935, PubMedID: 19372391
    2. Huang, Y, Pastor, W.A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D.R., Rao, A. (2010). PloS One. PubMedID: 20126651
    3. Kriaucionis, S. and Heintz, N. (2009). Science 324. 929-930, Epub 2009 Apr 16.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Reaction Protocol for EpiMark® 5-hmC and 5-mC Analysis Kit (E3317)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3317

  • 应用实例

    • AppNote_Use_of_EpiMark_5-hmC_and_5-mC_Analysis_Kit_on_Different_Tissue_Samples

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Does the T4-BGT show any site preference?
    2. How do I know if the glucosylation of 5-hmC in my DNA is complete?
    3. How much control DNA should I use in my qPCR?
    4. Do I need to do extra purification steps for a mammalian DNA prep in order to use it in a glucosylation reaction?