EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒可以选择性地结合和富集片段化的基因组 DNA 中的双链甲基化 CpG DNA，DNA 起始样本量可低至 5 ng。

此试剂盒通过人 MBD2 蛋白的甲基化 CpG 结合域将甲基化 DNA 从片段化基因组 DNA (5 ng–25 μg) 中分离出来，其中，人 MBD2 蛋白融合了人 IgG1 抗体的 Fc 尾部（MBD2-Fc）并偶联顺磁性 Protein A 磁珠（MBC2-Fc/Protein A 磁珠）。Protein A 上的一个位点可高亲和力地结合两个 Fc 结构域（Kd=10-7）。由于 Fc 片段是二聚体，因此在溶剂中，每个 Protein A 分子有四个暴露的 MBD2 结构域结合位点，从而将相对平衡常数提高了 100 倍。这种稳定的复合物可以选择性地结合含甲基化 CpG 的双链 DNA。经过简单漂洗和磁性捕获步骤之后，富集的 DNA 样本可以在 65℃ 下很容易地在少量无核酸酶水中温育洗脱，并且可随即对样本进行下游分析。下游分析方法有多种，包括：

  • 终点和实时 PCR 测定
  • 重亚硫酸盐转化后进行 DNA 扩增
  • 克隆和测序
  • 直接测序
  • 高通量测序文库制备
  • 针对 DNA 微阵列分析进行标记
  • 基于甲基化敏感限制性内切酶的测定

MBD-Fc 和 MCIp 最初由雷根斯堡大学的 Michael Rehli 开发，用于提高传统 CpG 结合技术的敏感性和特异性。

试剂盒组分： 

每个试剂盒包含的试剂足以从最高 100 μg 片段化的起始 DNA 中富集甲基化 DNA。如果每次实验的 DNA 起始样本量为 5 ng 到 10 μg，则此试剂盒提供的试剂足以用于 25 次反应。贮存温度为 4℃。如果存放时间超过 6 个月，则应将 MBD2-Fc 蛋白存放在 -20℃ 温度以下。

 

图 1：富集流程

EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒 | 

图 2：对使用 EpiMark 甲基化 DNA 富集试剂盒纯化的样本进行甲基化位点的终点 PCR 分析（LINE）。

EpiMark® 甲基化 DNA 富集试剂盒 | 

已分析的样本显示在胶图上方。
产品类别:
Methylome Analysis Products,
Epigenetic Analysis Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

应用:
DNA Enrichment

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E2600S     Multi-temperature    
        Bind/Wash Reaction Buffer (5X) B1032AVIAL 4 2 x 25 ml 5 X
        NaCl High-Salt Elution Buffer (2M) B1033AVIAL 4 1 x 15 ml Not Applicable
        Fragmented HeLa DNA N0484AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µg/ml
        LINE Primers for Methylated Controls N0485AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µM
        RPL30 Primers for Non-methylated Controls N0486AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µM
        MirA Primers for Input Control N0487AVIAL 4 1 x 0.02 ml 100 µM
        MBD2a-Fc Protein M0358AVIAL -20 1 x 0.025 ml 2 mg/ml
        Protein A Magnetic Beads S1426AVIAL 4 1 x 0.25 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    50 bp DNA Ladder（NEB #N3236）
    6 孔磁性分离架（NEB #S1506）
    Taq DNA 聚合酶（提供标准 Taq 缓冲液）（NEB #M0273）
    脱氧核糖核苷酸混合溶液（NEB #N0447）
    无核酸酶水

  • 优势和特性

    Features

    • 高亲和性结合力带来更高灵敏度。
    • 减少洗脱液用量可简化下游实验。
    • 操作简便，样本富集时间不到 2 小时。
    • 已富集的甲基化 DNA 样本可轻松连接双链接头，以便进行二代测序。
    • 从不同浓度范围的 DNA 投入量可获得纯度高的产物。

  • 方法概述

    方法概述

    第一步 — 片段化基因组 DNA
    必须采用超声处理、雾化或酶处理方式将 DNA 片段化为平均长度小于 1,000 bp。

    第二步 — 在 1X 结合/漂洗缓冲液中使 MBD2-Fc 与 Protein A 磁珠结合。
    在室温下温育反应 15 分钟。在结合/漂洗反应缓冲液中漂洗磁珠两次。

    第三步 — 将片段化的 DNA 添加到 MBD2-Fc/Protein A 磁珠里。
    在室温下温育反应 20 分钟。在室温下漂洗磁珠三次，每次漂洗五分钟，去掉未结合的 DNA。

    第四步 — 将富集的甲基化 CpG DNA 从磁珠上洗脱
    在 65℃ 温度下，在无 DNase 的水中温育样本 15 分钟。
     

    图 1：富集流程

     

    图 2：对使用 EpiMark 甲基化 DNA 富集试剂盒纯化的样本进行甲基化位点的终点 PCR 分析（LINE）。

    已分析的样本显示在胶图上方。

  • 相关产品

    相关产品

    • Taq DNA 聚合酶（提供标准 Taq 缓冲液）
    • 50 bp DNA Ladder
    • 6 孔磁性分离架
    • Deoxynucleotide Solution Mix

  • 参考文献

    1. Cross, S.H., Charlton, J.A., Nan, X., and Bird, A.P. (1994). Nat. Genet. . 6, 236-244.
    2. Fraga, M.F. et al. (2003). Nucleic Acids Res.. 31, 1765-1774.
    3. Gebhard, C. et al. (2006). Nucleic Acids Res. . 34, e82.
    4. Gebhard, C. et al. (2006). Cancer Research . 66, 6118-6128.
    5. Jacinto, F.V., Ballestar, E. and Esteller, M. (2008). Biotechniques . 44, 35, 37, 39 passim.
    6. Lister, R. et al. (2008). Cell. 133, 523-536.
    7. Rauch, T. and Pfeifer, G.P. (2005). Lab Invest.. 85, 1172-1180.
    8. Schilling, E. and Rehli, M. (2007). Genomics . 90, 314-323.
    9. Weber, M. et al. (2005). Nat. Genet. . 37, 853-862.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. DNA Fragmentation (E2600)
    2. Prebind MBD2a-Fc to Protein A Magnetic Beads (NEB #E2600)
    3. Capture Methylated CpG DNA (E2600)
    4. Wash Off Unbound DNA (E2600)
    5. Elute Captured Methylated CpG DNA (E2600)
    6. Capture and Elute Step for Control DNA (E2600)
    7. Downstream Analysis (NEB #E2600)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE2600

FAQs & 问题解决指南

  • 问题解决指南

    • EpiMark® Methylated DNA Enrichment Kit Troubleshooting Guide