rBC2LCN 人ES/iPS细胞 未分化标记

人ES/iPS细胞检测试剂盒

可检测未分化细胞数

rBC2LCN（AiLecS1）来源于Burkholderia cenocepacia，凝集素 BC2L-C 的N末端域在大肠菌表达的重组蛋白。 　　rBC2LCN 对人类ES/ iPS细胞表面足糖萼蛋白的粘蛋白O-型糖链-H-3型（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和性，因此 rBC2LCN 被认为是可以检测人类ES/ iPS细胞的未分化标志物。 　　通过 rBC2LCN 把糖蛋白（H-3 型聚合足糖萼）从人类ES/iPS细胞表面释放到培养液中。该试剂盒通过rBC2LCN和未分化标记抗体的 Sandwich Assay 测定法，定量测定从人类ES/iPS细胞表面释放到培养中的糖蛋白数量，进而可推算出人类ES/iPS细胞数。

◆特点

　●　通过对培养上清的分析，监测未分化细胞数的增减。

　●　因其测定对象为培养上清，不会在检查过程中消耗细胞数量，且可在此过程中继续进行细胞培养

　●　少量的培养上清（50 μL）即可分析

　●　采用ELISA测定法，可简单快速的处理多样品

　试剂盒构成

构成品品名	容量×数量
rBC2LCN固相检测板	96 well×1板
HRP标识抗体溶液	400 μL×1支
阴性对照品	1 mL×1支
阳性对照品	100 μL×1支
稀释溶液	15 mL×1支
清洗液（10×）	100 mL×1支
TMB溶液	10 mL×1支
显色停止液	10 mL×1支
封板贴	4片

◆原理

　●标准曲线制作

　　该试剂盒中未含有绘制标准曲线用的标准品。因此，请按照下述顺序调制标准品后，再行绘制标准曲线：

　　　1.　在未分化维持培养条件下进行人ES/ iPS细胞培养，更换培养基的第二天（18至24小时后）回收培养上清。

　　　2.　细胞剥离，测定人S/ iPS细胞数。

　　　3.　计算出回收到的培养上清中所含的人ES/ iPS细胞数。如：培养基量 5 mL，测定细胞数为 5×10⁶ cells 时，则回收培养上清中的

　　　　　人ES/ iPS细胞数即为 1×10⁶ cells/mL。

　　　4.　利用回收的培养上清未分化维持用培养基或已分化培养基，制成已知细胞浓度的稀释系列，以绘制标准曲线。

◆分化诱导时的使用案例

　　　1.　在未分化维持培养时，对人ES/iPS细胞的培养上清进行取样，计算人ES/iPS细胞数。

　　　2.　在分化用培养基中对第１项的培养上清进行稀释，制成稀释系列，以绘制该试剂盒的标准曲线。

　　　3.　使用本试剂盒测定可确认人ES/iPS细胞数的培养上清。

　　　4.　推算分化条件下残存的人ES/iPS细胞数

【细胞株间和培养基间的比较】

　　在各个未分化维持用培养基（培养基A、B、C、D）中分别培养人类iPS细胞201B7株和253G4，更换培养基后第二天回收培养上清。计算细胞数量，用各个未分化维持用培养基将各培养上清稀释至2,000cells/mL，进而测定该试剂盒的吸光度。测定结果如下图所示。结果表明，即使细胞株或培养基等培养条件的细胞数量恒定，信号强度也有差异。因此，必须为培养条件绘制标准曲线。

【人类iPS细胞培养上清的测定】

　　用 StemSure^® hPSC 培养基培养人类iPS细胞201B7株，更换培养基第二天回收该培养基的培养上清。于此同时，计算细胞数量，阶段性的在 StemSure^® hPSC 培养基中稀释培养上清，并将稀释后的培养上清用试剂盒检测。结果可得到一个极高相关系数的线性公式。根据这个线性公式求出该培养条件下的人类iPS细胞检测下限值^※为108 cells/mL。

※检测下限值：根据培养基背景吸光度平均值+3.3SD和线性公式计算出来的细胞数量。

【分化细胞培养上清和人类iPS细胞培养上清液混合检测】

　　将含有成纤维细胞和人膝关节软骨（NHAC-kn）细胞的血清培养基上清与人类iPS细胞培养上清混合后，确认能否测定添加在其中的未分化细胞标志物。将iPS细胞混合比例0~20%（0～2×10⁴ cells/mL：总细胞数 1×10⁵ cells/mL）的人iPS细胞培养上清，混合到成纤维细胞和人膝关节软骨细胞培养上清中，用试剂盒检测。在血清和成纤维细胞存在的条件下，可在培养上清中测定出人iPS细胞培养上清。

　　另外还可从成纤维细胞/人膝关节软骨细胞和iPS细胞的混合试验材料中得出一个线性公式，根据该公式可求出人iPS细胞的检测下限值^※，分别为：170 cells/mL 和 96 cells/mL。

　使用注意项

　　●　由于细胞株、培养基种类等培养条件的不同，会导致信号轻度和细胞数的关系产生差异，所以必须绘制细胞株、未分化维持培养条

　　　  件、分化诱导培养基标准曲线。

　　●　不同培养条件下，不能依靠信号强弱来评定未分化性。未分化性的评定一定要在相同培养条件下进行。

　　●　用该试剂盒测算出来的ES/iPS细胞数与实际细胞数未必一致。对未分化维持状态和进行细胞分化的监控，也是需要参考的指标之一。

欲了解更多相关资料请点击文字：无损监测具有致瘤性人ES/iPS细胞的技术

说明书.pdf

人类ES/iPS细胞测定试剂盒单页_1606WAAU01.pdf

◆相关产品

●荧光标识rBC2LCN
　　添加到人类ES/iPS细胞培养液中，可为人类ES/iPS活细胞染色。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
180-02991	rBC2LCN-FITC【AiLecS1-FITC】 Ex.495 nm,Em.520 nm	细胞染色用	100 μL
186-02993			100 μL×5
186-03211	rBC2LCN-547【AiLecS1-547】 Ex.551nm,Em.565nm	细胞染色用	100 μL
182-03213			100 μL×5
185-03161	rBC2LCN-635【AiLecS1-635】 Ex.634 nm,Em.654 nm	细胞染色用	100 μL
181-03163			100 μL×5

●rBC2LCN-PE23
　　仅加入含有人类ES/ iPS细胞的培养液中，可以选择性地杀死人类ES/ iPS细胞。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
180-03231	rBC2LCN-PE23	细胞培养用	100 μL
186-03233			100 μL×5

●rBC2LCN汽提溶液
　　可将与人类ES/ iPS细胞表面糖链聚合起来的rBC2LCN从细胞上剥落下来。rBC2LCN剥落后，细胞还可添加其他抗体进行染色、培养。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
182-03171	rBC2LCN Stripping Solution【AiWashS1】	细胞培养用	10 mL

●BC2LCN凝聚素, 重组体、溶液
　　集中未标识的rBC2LCN

生产编号	品名	规格	容　量	保存温度·法规
029-18061	BC2LCN【AiLecS1】Lectin,recombinant, Solution	糖链研究用	1 mg
025-18063			1 mg×5

●StemSure^® hPSC培养基Δ
　　无饲养层细胞条件下可用于维持培养人类ES/iPS细胞的无血清液态培养基。原料不含动物体成分。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
197-17571	StemSure® hPSC Medium Δ	细胞培养用	100 mL
193-17573			100 mL×4
064-05381	Fibloblast Growth Factor (basic),Human,   recombinant, Animal-derived-free 【bFGF/FGF2】	细胞生物学用	50 μg
068-05384			100 μg
060-05383			1 mg
160-27051	hPSC Dissociation Solution 人类iPS細胞用单体细胞分散剂。不含酶、动物体来源材料。	细胞培养用	100 mL

●StemSure^®系列
　　通过小鼠ES细胞D3株或人类iPS细胞201B7株，进行品质测验。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
197-16275	StemSure® D-MEM with Phenol Red and Sodium   Pyruvate	细胞培养用	500 mL
197-16775	StemSure® Serum Replacement	细胞培养用	500 mL
198-15781	StemSure® 10mmol/l 2-Mercaptoethanol Solution（×100）	细胞培养用	100 mL
195-15791	StemSure® 50mmol/l Monothioglycerol Solution（×100） 可与2ME同等使用的还原剂。医药用外不适用。	细胞培养用	100 mL
190-15805	StemSure® 0.1w/v% Gelatin Solution	细胞培养用	500 mL
195-16031	StemSure® Freezing Medium 含有BSA的ES细胞・iPS细胞用冻存液	细胞培养用	100 mL
197-17831	StemSure® hPSC Freezing Medium, AF 无动物体成分的人类ES·iPS细胞用冻存液	细胞培养用	100 mL
199-16051	StemSure® LIF,Mouse,recombinant,Solution	细胞培养用	106 units
195-16053			106 units×10

●Y-27632, MF
　　该品作为培养基添加物被登记在原药等登录原簿（MF）中。以自主规格为基础，实现原料管理、制造工程和分析实验的有效检验，创建可以恒常稳定产品品质的体制。＜点击此处＞

●ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞的未分化功能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。＜点击此处＞

●液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。＜点击此处＞

Q：　培养上清中会有糖萼蛋白残留吗？

A：　糖萼蛋白会被释放到培养上清中。培养上清在37℃条件下保存８天，信号都不会减弱，因此作为本试剂盒测试对象的糖萼蛋白上的糖链

         在此期间都能保持其稳定性。如果冷冻保存的情况下，糖链安定性可稳定维持４个月。（但切记避免反复冻融。）

Q：　糖萼蛋白可作为标准品使用吗？

A：　该试剂盒是用于检测糖萼上的糖链的。因合成附有糖链的蛋白质很困难，所以生产出试剂盒适用的标准品也不易。虽然可能可以制作出不

         带糖链的糖萼蛋白，但是否能够作为标准品就不得而知了。

Q：　释放的足糖萼蛋白长度是恒定的吗？

A：　足糖萼蛋白是氨基酸配列恒定的，分子量为 55 kDa 的蛋白质，但实际上足糖萼蛋白上还附有Ｏ型糖链、N型糖链和葡糖胺聚糖，分子量

         为240 kDa 以上的大型粘蛋白分子。因是由糖链修饰程度和性质不同的分子群混合起来的异质糖蛋白质群，分子量并不是恒定的。

         电泳分子量＞240kDa。

Q：　在三维细胞培养中，足糖萼蛋白也能释放出来吗？

A：　是的，三维培养中也能释放足糖萼蛋白。

Q：　足糖萼蛋白的作用是什么？

A：　足糖萼蛋白在人类iPS细胞中的机能暂时未知，但和未分化细胞的形态、增值性、分化能等有着密切的关系。它是发现肾脏肾小球足细胞的

         主要糖蛋白，在足细胞形态的形成和足细胞机能中起重作用。足糖萼蛋白缺失的小鼠，会引起肾脏异常致死。

Q：　回收培养上清时，是否需要进行混匀？

A：　是的。摇晃孔盘/孔板轻轻混匀后，再进行培养上清的回收。

Q：　阳性对照品和阴性对照品的使用目的是什么？

A：　用以确认试剂盒反应系是否正常进行。

Tateno, H., Onuma, Y., Ito, Y., Hiemori, K., Aiki, Y., Shimizu, M., Higuchi, K., Fukuda, M., Warashina, M., Honda, S., Asashima, M. and Hirabayashi, J.: Sci. Rep., 4, 4069 (2014).

未分化人ES/iPS细胞检测试剂

仅需添加培养液便可检出人ES/iPS细胞！

荧光标记 rBC2LCN（AiLecS1）

◆rBC2LCN（AiLecS1）

　　rBC2LCN（AiLecS1）是在伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）来源凝集素 BC2L-C 的 N末端域表达的重组凝集素。

　　由于 rBC2LCN 对存在于人ES/iPS细胞表面的足糖萼蛋白（Podocalyxin）上的粘蛋白样O-型糖链的H型3（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和力，因此可用作人 ES/iPS 细胞的未分化标志物。

　　本产品是荧光染色标记，能直接添加到人 ES/iPS 细胞的培养液中，实现未分化活细胞分析。 适用于未分化细胞检测用标记。可用于细胞染色，流式细胞仪。另外，使用本品持续培养数日已确认细胞无毒性。

　　我们供应绿色荧光标记（FITC），黄色荧光标记（Cy3），红色荧光标记（Cy5）的三种类型的系列商品。

◆特点

●　添加到培养基即可进行染色

●　无需固定细胞，活细胞也可直接进行明显染色

●　细胞毒性低，染色后也可培养

●　识别 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4 细胞表面存在的糖链

●　可用于细胞染色和流式细胞仪

◆产品概述

●　已进行无菌试验（0.1 μm 过滤器进行灭菌）

●　PBS(-) 溶液

●　使用时稀释比

　  Live Cell Imaging 1：100～1,000
　  Flow Cytometry 1：100～1,000

●　激发波长/发射波长

	Excitation	Emission
rBC2LCN-FITC	495 nm	520 nm
rBC2LCN-547	551 nm	565 nm
rBC2LCN-635	634 nm	654 nm

◆使用方法

细胞染色

活细胞染色（Live Cell Imaging）

1. 准备培养中的人 ES/iPS 细胞

2. 每 1 mL 的培养基添加 1~10 μL 的荧光标记 rBC2LCN

3. 37℃，5％CO₂ 孵育 30 分钟。

4. 更换新的培养基或者 HBSS(+)。

5. 利用荧光显微镜观察

固定细胞染色

1. 准备培养中的人 ES/iPS 细胞

2. 除去培养基，用 HBSS(+) 洗净。

3. 添加 4%多聚甲醛（PFA）溶液，室温静置 10～20 分钟。

4. 除去 PFA 后，用 D-PBS(-) 洗净三次。

5. 添加 D-PBS(-)。

6. 每 1 mL 的 D-PBS(-) 添加 1～10 μL 荧光标记 rBC2LCN。

7. 37℃，5% CO₂ 孵育 30 分钟。

8. 更换 D-PBS(-)。

9. 利用荧光显微镜观察。

流式细胞仪

1. 准备培养中的人 ES/iPS 细胞。

2. 使用细胞分散液，分散成单细胞。

3. 将细胞分散液移至管内，1,000 rpm 离心 3 分钟。

4. 除去上清液，用 FCM Buffer* 重悬细胞，离心后，舍弃上清液。

* FCM Buffer： D-PBS(-)和HBSS(-)含有 10 mmol/L EDTA，1% BSA

5. 用 FCM Buffer 重悬出 5×10⁶ cells/mL 的细胞悬浮液

6. 每 1 mL 细胞悬浮液，添加 1～10 μL 的荧光标记 rBC2LCN。

7. 室温，避光静置30分钟。

8. 1,000 rpm 离心三分钟，除去上清液。

9. 用 FCM Buffer 重悬细胞，离心后，除去上清液。

10.  适量的 FCM Buffer 再悬浮细胞。

11.  进行流式细胞术。

使用注意

1. rBC2LCN 染色可以维持 2~3天。

2. 使用含有血清的培养基可能使信号背景变高

3. 根据流式细胞仪进行细胞分选时，当细胞分散或 FCM 缓冲液的终浓度到达 10 μmol/L 时，请添加 Y-27632。

◆人iPS细胞的活细胞染色（Live Cell Imaging）

●　用 rBC2LCN-FITC， rBC2LCN-635 以及 Hoechst33342 对人 iPS 细胞 201B7 株进行染色处理。（无细胞固定）

（稀释倍数　1：1,000）

●　用 rBC2LCN-FITC、Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-4 对人 iPS 细胞 201B7 株进行染色处理。

　  2小时后确认染色图像。（未固定细胞）

（稀释倍数　1：100）       

★　与 Tra-1-60、Tra-1-81 相比较，rBC2LCN 的活细胞染色度更强。

★　即使交换培养基，rBC2LCN 染色第二天后染色效果依然明显。

◆人ES细胞的活细胞染色（Live Cell Imaging）

　　使用 rBC2LCN-FITC 对人 ES 细胞 WA01 株进行染色（未细胞固定）。细胞的一部分无法维持未分化状态而进行分化。如果使用 rBC2LCN-FITC 对活细胞进行染色，以维持未分化状态部分已染色，而已分化部分未染色来进行区分。

＜数据提供 国家研究与发展公司先进工业科学和技术研究院 新药开发的基础研究部门恭子小沼老师，伊藤弦老师＞

◆人 iPS 细胞固定后染色

　　将人 iPS 细胞 201B7 株用多聚甲醛固定后，使用 rBC2LCN 和 DAPI 进行细胞染色。

对于人 iPS 细胞毒性评估

　　向人 iPS 细胞 201B7 株的培养液中分别添加其 1/1,000、1/100、1/50 量的 rBC2LCN-FITC，持续培养。其结果是，不存在 rBC2LCN-FITC 浓度对毒性影响，不同浓度的细胞增殖程度相同程度。

　

　

〔细胞株〕
　人iPS细胞 201B7株

〔培养基组成〕
　StemSure^® hPSC培养基Δ+35 ng/mL bFGF

〔涂层〕
　Matrigel^® hESC-Qualified Matrix

〔细胞接种数目〕
　4×10⁴ cells/well（12孔板）

　使用Flow Cytometry进行人iPS细胞分离

　使用rBC2LCN-FITC及rBC2LCN-6547、rBC2LCN-635对人iPS细胞201B7细胞株和人正常二倍体成纤维细胞染色，进行流式细胞术。

　实验结果：未分化的人iPS细胞与分化的人二倍体成纤维细胞成功分离。

◆产品列表

产品编号	产品名称	等级	容　量
180-02991 186-02993	人iPS未分化标记染料rBC2LCN-FITC (AiLecS1-FITC) rBC2LCN-FITC 【AiLecS1-FITC】   　　Ex. 495nm, Em. 520nm	用于细胞染色	100 μL   100 μL×5
186-03211 182-03213	人iPS未分化标记染料rBC2LCN-547   (AiLecS1-547) rBC2LCN-547 【AiLecS1-547】   　　Ex. 551nm, Em. 565nm	用于细胞染色	100 μL   100 μL×5
185-03161 181-03163	人iPS未分化标记染料rBC2LCN-635   (AiLecS1-635)　 rBC2LCN-635 【AiLecS1-635】   　　Ex. 634nm, Em. 654nm	用于细胞染色	100 μL   100 μL×5

◆相关产品

★ rBC2LCN 剥离液 ★

本产品能够将结合在人ES细胞▪ 人iPS细胞表面糖链的 rBC2LCN 凝集素从细胞里面剥离出来。剥离 rBC2LCN 之后的细胞能够进行抗体染色，可以继续培养。

产品编号	产品名称	等级	规格
182-03171	rBC2LCN剥离溶液 rBC2LCN Stripping Solution 【AiWashS1】	用于细胞培养	10 mL

★ BC2LCN 凝聚素，重组体、溶液未标识 rBC2LCN 系列

产品编号	产品名称	等级	规格
029-18061 025-18063	BC2LCN （AiLecS1）凝集素　 BC2LCN 【AiLecS1】 Lectin, recombinant, Solution	糖链研究用	1 mg 1mg×5

★ StemSure^® hPSC 培养基Δ无饲养层细胞条件下可用于维持培养人多功能干细胞（ES/iPS细胞）的无血清液态培养基。原料不含动物体来源成分。

产品编号	产品名称	等级	规格
197-17571 193-17573	StemSure人多能干细胞培养基 StemSure® hPSC Medium Δ	用于细胞培养	100 mL 100 mL×4
064-05381 068-05384 060-05383	成纤维细胞生长因子（碱性），人，重组，无动物衍生物 Fibloblast Growth Factor (basic), Human, recpmbonant,   Animalderived-free 【bFGF/FGF2】	細胞生物学用	50 μg 100 μg 1mg
160-27051	hPSC解离溶液 hPSC Dissociation Solution 　人类iPS細胞用单体细胞分散剂。	用于细胞培养	100 mL

★ StemSure^® 系列
   已通过小鼠 ES 细胞 D3 株品质测验。

产品编号	产品名称	等级	规格
197-16275	StemSure D-MEM（高糖）含酚红和丙酮酸钠 StemSure® D-MEM with Phenol Red and Sodium Pyruvate	用于细胞培养	500 mL
198-15781	StemSure10 mmol/L 2-巯基乙醇 StemSure® 10mmol/L 2-Mercaptoethanol Solution（×100）	用于细胞培养	100 mL
195-15791	StemSure50 mmol/L 硫代甘油（×100） StemSure® 50mmol/L Monothioglycerol Solution（×100）   可与2ME同等使用的还原剂。医药用外不适用。	用于细胞培养	100 mL
190-15805	StemSure 0.1w/v%明胶溶液 StemSure® 0.1w/v% Gelatin Solution	用于细胞培养	500 mL
195-16031	StemSure干细胞冻存液 StemSure® Freezing Medium 含有BSA的ES细胞・iPS细胞冻存液	用于细胞培养	100 mL
197-17831	StemSure® 人多能细胞冻存液 StemSure® hPSC Freezing Medium, AF 无动物体成分的ES·iPS细胞冻存液	用于细胞培养	100 mL
199-16051 195-16053	StemSure® 白细胞抑制因子溶液,小鼠，重组 StemSure® LIF, Mouse, recombinant, Solution	用于细胞培养	106 units   106 units×10

●　ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞的未分化能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。

●　液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。

参考文献

·   Onuma, Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 431, 524, (2013).

·   Tateno, H., et al.: Stem Cells Transl. Med., 2, 265, (2013).

·   Tateno, H., et al.: Sci. Rep., 4, 4069, (2014).

rBC2LCN

人ES/iPS细胞 未分化标记

　　rBC2LCN 对未分化ES/IPS细胞表面存在的糖链有极高的亲和性，因此，rBC2LCN 可作为ES/iPS的细胞标志。

　　使用荧光标记的 rBC2LCN，只要直接添加到培养液中，即可进行人ES/iPS活细胞染色。将与绿杆脓菌毒素（PE23）结合的 rBC2LCN-PE23 同样添加到培养液中，能杀死人ES/iPS细胞。

◆案例

■人iPS细胞的活细胞染色（Live Cell Imaging）

　　

分别用 rBC2LCN 和 Tra-1-81 给人iPS细胞 201B 株染色，２小时后确认染色图像：rBC2LCN 染色细胞比 Tra-1-81 染色细胞更能清晰地观察到荧光的部分。

rBC2LCN	Tra-1-81	（稀释倍数1:100）

■去除间充质干细胞分化中的人iPS细胞

　　

疾病患者源人iPS细胞分化间充质干细胞：将 rBC2LCN-PE23 加入上述混合培养液，终浓度为 10 μg/mL。添加24小时后人 iPS 细胞群开始崩解，48小时后人iPS细胞渐渐去除。

　　另外，rBC2LCN-PE23 添加48小时后，间充质干细胞不受影响，细胞仍保持活性。

数据提供：东京慈惠会医科大学 再生医学研究部  岡野James洋尚先生