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ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEBridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HFv2）内含优化的 BsaI-HFv2 和 T4 DNA 连接酶的混合液。利用 Golden Gate 方法，混合液可以完成多个片段/模块的组装。试剂盒还随附目的质粒 pGGAselect，为组装提供骨架，同时为亚克隆提供内切酶酶切位点，以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。

Golden Gate 组装技术（1,2）可高效、无痕地克隆组装 DNA 片段。该技术起源于 1996 年，当时是第一次使用单一的 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次（3）或同时（4）将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsaI 的识别位点为 GGTCTC（N1/N5），其中 GGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段的连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。 组装产物随时间逐渐积累。

该方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs（Transcription Activator Like Effectors，转录激活因子样效应物）（5），以及 TALENs（TALE 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）（6）。Golden Gate 方法也适用于单一目的基因的克隆实验以及不同来源基因的文库构建。观看此视频教程，了解更多 Golden Gate 组装工作流程。

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

请注意，虽然 Golden Gate 组装中常用到 BsaI 内切酶，但 NEB 的试剂盒和操作步骤中则使用 BsaI-HFv2，该酶是原酶经过改造和优化的升级版。

图 1：概述：Golden Gate 组装的操作流程
ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |
图 2：Golden Gate 工作流程ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |
简单来说，Golden Gate 组装需要 IIS 型内切酶识别位点，在本示例中，BsaI-HFv2 识别序列（GGTCTC）加在 dsDNA 片段双侧末端。酶切后，识别位点不再存在，每个片段产生 4 个碱基突出末端，用于引导组装。
图 3：可高效精确地实现 24 个片段的 Golden Gate 组装ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |
遵循本文推荐的循环步骤，在含有 lacI/lacZ 的表达框中组装 24 个片段。虽然 30 个循环足以实现 24 个片段组装，但 BsaI-HFv2 和 T4 DNA 连接酶的稳定性允许连续进行 45 和 60 个循环的组装且背景低。（a）组装效率和（b）组装准确性与循环次数的关系如图所示。
图 4：

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |

pGGA 是一个大小为 2,200 bp 的克隆载体，可用于 Golden Gate 组装。该质粒含有两个 BsaI 位点；用 BsaI 酶切会释放 87 bp 的片段和 2,133 bp 的载体骨架片段，可接收插入片段或组装片段。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
DNA Assembly and Cloning,
High-throughput cloning and automation solutions,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1601S     -20    
        NEBridge® Golden Gate Enzyme Mix (BsaI-HFv2) M2616AVIAL -20 1 x 0.02 ml Not Applicable
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        pGGAselect DNA N0309AAVIAL -20 1 x 0.1 ml 75 ng/µl
    • E1601L     -20    
        NEBridge® Golden Gate Enzyme Mix (BsaI-HFv2) M2616AAVIAL -20 1 x 0.1 ml Not Applicable
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        pGGAselect DNA N0309AAVIAL -20 1 x 0.1 ml 75 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 用户自备的插入片段
    • 感受态细胞
    • 其它转化试剂

  • 优势和特性

    Features

    • 无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在
    • 单次反应即可按顺序组装多个片段
    • 也可用于单个片段克隆
    • 有效组装高 GC 区和重复区
    • 兼容片段长度广（< 100 bp to > 15 kb）
    • 登陆 GoldenGate.neb.cn 使用免费的在线工具
    • 2 年保质期

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    • Q5® 定点突变试剂盒
    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
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    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Turbo E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Stable E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 10-beta E. coli 电转感受态细胞
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    • NEB®  PCR 克隆试剂盒（不含感受态细胞）
    • T7 表达 E. coli 感受态细胞（高效级）
    • Nuclease-free Water
    • r3733-bsaI-hf-v2
    • Esp3I
    • BbsI-HF®
    • BsmBI-v2

  • 参考文献

    1. Engler, C. et al (2008). PLoS ONE. 3: e3647.
    2. Engler, C. et al (2009). PLoS ONE. 4: e5553.
    3. Lee, J.H. et al (1996). Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 13; 139-145.
    4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1996). Gene. 168, 31-35.
    5. Weber, E. et al (2001). PLoS ONE. 6; e19722.
    6. Christian, M. et al (2010). Genetics. 186, 757-761.
    7. Potapov, V. et al. (2018). Comprehensive Profiling of Four Base Overhang Ligation Fidelity by T4 DNA Ligase and Application to DNA Assembly. ACS Synth. Biol. 7, 11, 2665-2674. DOI: 10.1021/acssynbio.8b00333,

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Golden Gate Assembly Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    2. Transformation Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    3. Recommended Screening Protocols for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2)
    4. 52-Fragment Golden Gate Assembly using BsaI-HF®v2 (NEB #E1601)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE1601

  • 使用指南

    • Expanded “assembly standards” for MoClo, GoldenBraid2.0 and other modular Golden Gate Assembly methods
    • Insert Considerations When Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2) (NEB #E1601)
    • Technical Tips For Optimizing Golden Gate Assembly Reactions

  • 应用实例

    • Breaking through the Limitations of Golden Gate Assembly
    • Accelerating DNA Construction to Protein Expression: A Rapid 1-Day Workflow Using NEBridge® Golden Gate Assembly 

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • DNA Sequences and Maps Tool
    • NEBridge® Golden Gate Assembly Tool
    • NEBridge® Ligase Fidelity Tools

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Why does the Golden Gate Assembly Mix now feature BsaI-HFv2?
    2. What is the mechanism for Golden Gate Assembly?
    3. What affects the efficiency of Golden Gate Assembly?
    4. Why do many of the published Golden Gate Assembly articles feature precloned inserts as opposed to inserts generated by PCR?
    5. Using purified amplicons directly without precloning seems much easier, but is the assembly efficiency decreased?
    6. Can PCR amplicons be used directly in assembly reactions without purification?
    7. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    8. What if there are internal BsaI and BsmBI sites in my insert sequences?
    9. Why do assembly reactions end with a 5 minute, 60°C incubation step?
    10. How can I minimize PCR-generated errors in my amplicon inserts?
    11. Can the Golden Gate Assembly reactions be scaled down?
    12. Can I use other competent E. coli strains than NEB 10-beta? Can I use subcloning efficiency cells?
    13. What is an appropriate negative control for Golden Gate Assembly?
    14. How many cycles are optimal?
    15. Which kit from NEB should I use for Golden Gate Assembly—the BsmBI-v2 kit (NEB #E1602) or the original BsaI-HFv2 kit (NEB #E1601)?
    16. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    17. How can I access pGGAselect as a GenBank or FASTA file?
    18. Will EDTA interfere with downstream BsaI restriction and ligation?
    19. Why is there a 55°C, 5 min heat step at the end of the assembly reaction?

  • 实验技巧

    强烈推荐使用 NEB Golden Gate 组装工具（GoldenGate.neb.cn）；此工具可检查插入片段的内部是否有 IIS 型限制性内切酶位点，帮助设计引物扩增插入片段用于 Golden Gate 组装。设计的引物应在识别位点两侧的 5′ 端包含 6 个碱基、识别位点，以及有助于插入片段正确退火和连接的 4 碱基突出末端。所有突出末端将自动设计为非回文序列（以消除自插入连接）、唯一且方向正确，以确保正确组装。

     

    NEB 的不断研究加深了我们对连接酶保真性的认识，包括评价末端连接保真度的多种手段的开发，从而更好地预测何种突出末端具有更高连接保真度（Potapov V. et al. (2018) ACS Synth. Biol，7，2665–2674.）。连接酶保真度信息可与 NEB Golden Gate 组装试剂盒结合使用，实现高效且准确的复杂组装。更多详情请登陆 www.neb.cn/GoldenGate。

     

    vNEB 开发了连接酶保真性分析软件，以协助设计高保真 Golden Gate 组装：

    • Ligase Fidelity Viewer – 使突出末端连接偏好可视化
    • GetSet™ – 预测高保真连接位点组合
    • SplitSet™ – 将 DNA 拆分成易于高保真无缝组装的 DNA 序列

    更多详情请访问 neb.cn/research/NEBeta-tools 

     
    标准 Golden Gate 操作流程建议采用 30 个循环，酶切和连接交替进行。BsaI-HFv2、BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶非常稳定，支持进行多达 60 个循环，仍保持高效率和高保真性。考虑是否可以通过增加更多循环数来优化实验流程。

BsaI |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

BsaI 提供高保真版本 BsaI-HF®v2（NEB #R3733）。

高保真（HF）限制性内切酶在 CutSmart 缓冲液中具有 100% 活性；统一缓冲液意味着更加直接、简化的样品处理过程。HF 内切酶还会显著降低星号活性。所有 HF 内切酶均符合省时酶（Time-Saver）标准，可在 5-15 分钟内酶切底物 DNA，也可实现过夜酶切而不会造成 DNA 降解。HF 限制性内切酶在改造时便将性能作为重要指标，可在更宽的条件范围下具有完全活性，最大限度地减少非特异性酶切产物，同时为实验设计提供灵活性。

产品来源

E. coli 菌株，携带有克隆自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）6-55（Z. Chen）的 BsaI 基因

产品类别:
Discontinued (<3 years)

  • 特性和用法

    单位定义

    一个单位是指在 50 µl 的总反应体系中，37℃ 条件下，1 小时内酶切 1 µg pXba DNA 所需的酶量。

    反应条件

    1X CutSmart® 缓冲液
    Incubate at 37°C

    1X CutSmart® 缓冲液
    50 mM Potassium Acetate
    20 mM Tris-acetate
    10 mM Magnesium Acetate
    100 µg/ml BSA
    (pH 7.9 @ 25°C)

    在不同缓冲液中的活性

    NEBuffer™ 1.1: 75%
    NEBuffer™ 2.1: 75%
    NEBuffer™ 3.1: 100%

    稀释兼容性

    • 稀释液 B

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    300 mM NaCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    500 µg/ml BSA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 20 minutes

    甲基化敏感性

    dam 甲基化: 不敏感
    dcm 甲基化: 某些甲基化与酶切位点的重叠组合影响酶切
    CpG甲基化: 某些甲基化与酶切位点的重叠组合阻断酶切

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    单独销售的组分

    • 6X 紫色凝胶上样染料
    • CutSmart® 缓冲液

  • 注意事项

    1. dcm 甲基化与酶切位点重叠阻断酶切。哺乳动物基因组 DNA 的酶切位点与某些 CpG 甲基化重叠组合阻断酶切。
    2. 50℃ 条件下活性为 100%。
    3. 在 NEBuffer r1.1 缓冲液中可能出现星号活性。
    4. 因为反应中酶的稳定性，即使温育时间超过 1 小时也不会提高酶切效率，除非增加酶量。如需了解更多信息，请参阅限制性内切酶在反应中的活性。
    5. 甘油浓度 >5% 条件下可能出现星号活性

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions
    2. Restriction Digest Protocol
    3. Double Digest Protocol with Standard Restriction Enzymes

  • 使用指南

    • Activity at 37°C for Restriction Enzymes with Alternate Incubation Temperatures
    • Activity of Restriction Enzymes in PCR Buffers
    • Cleavage Close to the End of DNA Fragments
    • Dam and Dcm Methylases of E. coli
    • Digestion of Agarose-Embedded DNA: Info for Specific Enzymes
    • Double Digests
    • Effects of CpG Methylation on Restriction Enzyme Cleavage
    • Expanded “assembly standards” for MoClo, GoldenBraid2.0 and other modular Golden Gate Assembly methods
    • Heat Inactivation
    • NEBuffer Activity/Performance Chart with Restriction Enzymes
    • Optimizing Restriction Endonuclease Reactions
    • Restriction Endonucleases – Survival in a Reaction
    • Restriction Enzyme Diluent Buffer Compatibility
    • Restriction Enzyme Tips
    • Single Letter Codes
    • Star Activity
    • Technical Tips For Optimizing Golden Gate Assembly Reactions
    • Traditional Cloning Quick Guide

  • 应用实例

    • Breaking through the Limitations of Golden Gate Assembly

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Alphabetized List of Recognition Sequences
    • Cleavage of Supercoiled DNA
    • Compatible Cohesive Ends and Generation of New Restriction Sites
    • Dam-Dcm and CpG Methylation
    • Enzymes with Nonpalindromic Sequences
    • Frequencies of Restriction Sites
    • Isoelectric Points (pI) for Restriction Enzymes
    • Isoschizomers
    • NEB Diluent and Buffer Table
    • Time-Saver™ Qualified Enzymes
    • Type IIS Restriction Enzymes
    • Why Choose Recombinant Enzymes?

  • Web 工具

    • Competitor Cross-Reference Tool
    • DNA Sequences and Maps Tool
    • Double Digest Finder
    • Enzyme Finder
    • NEBcutter™ v3.0
    • NEBioCalculator®
    • REBASE®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Which restriction enzymes are used in Golden Gate Assembly?
    2. Which restriction enzymes are used in GoldenBraid Assembly?
    3. Which NEB restriction enzymes are supplied with Gel Loading Dye, Purple (6X)?
    4. What is the activity of the Type IIS restriction enzyme BsaI-HFv2 (NEB #R3733) in T4 DNA Ligase Buffer?
    5. Is this enzyme sensitive to dam, dcm or mammalian CpG methylation?
    6. Can Gel Loading Dye, Purple 6X (B7024) be stored in cold temperatures?

  • 问题解决指南

    • Restriction Enzyme Troubleshooting Guide

  • 实验技巧

    用于 Golden Gate 组装的限制性内切酶
     
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