通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测
筑波大学生 命环境系1）、北海道大学 医学研究院 微生物学免疫学领域2）
浦山俊一1）、福原崇介2）
◆前言
人类发现病毒的存在大约是在1900年，其契机是动植物间出现的一种原因不明的传染病。在寻找致病病原体的过程中，由于它比当时已知的最小病原体（微生物）更小，且具有异质性，因此被命名为"病毒"。此后，研究人员在所有生物体内都发现了各种不同类型的病毒，现在病毒被认为是细胞生物体内普遍存在的绝对寄生因子。
RNA病毒是以RNA为基因组的病毒的总称，从狭义上讲，是指去除在其生命周期内同时利用DNA的逆转录病毒（例如HIV的基因组是RNA，但它能经过逆转录进入宿主的基因组DNA中）的病毒群。它包含多种对人类，家畜和植物等经济型生物有重大危害的病毒，例如典型的SARS-CoV-2、流感病毒、寨卡病毒和丙型肝炎病毒。
对于肉眼无法看见且难以培养的RNA病毒，”发现”其存在至关重要。不仅是医疗领域，还需要更进一步展开关于这些RNA病毒的起源和传播的全健康（one health）研究，并从包含RNA病毒的全球生态系统的角度对其进行认识。因此，基于各种目的的RNA病毒检测方法也应运而生，本文将基于"双链RNA"的方法介绍其应用于高等动物组织的案例。
◆利用双链RNA检测RNA病毒的原理
不携带RNA病毒的细胞几乎不存在长双链RNA。但是，存在RNA病毒时，RNA病毒基因组的复制过程中会产生双链RNA，因此，如果在生物样品中检测出双链RNA，则表明存在RNA病毒1），此处的关键在于双链RNA的纯化技术。纯化主要使用的是利用双链RNA结合于纤维素树脂的性质的柱色谱法1-3），和使用双链RNA结合蛋白和抗双链RNA抗体的方法，以及通过DNA和单链RNA的分解留下双链RNA的方法。通过解码得到的双链RNA，也可以选择性地确定RNA病毒基因组4-8）。
◆动物组织中的双链RNA的纯化和解码
由于几乎没有从高等动物样品纯化双链RNA的报告，因此我们首先使用被广泛使用的纤维素树脂进行纯化。使用市售肉糜的测试结果表明，rRNA的读数比例的约占90%，通过分子内互补结合，残留了大量具有部分双链RNA结构的rRNA（图1左）。相同的方法应用于真菌、植物、昆虫时，rRNA读数比例仅为百分之几，这表明这是高等动物样品特有的课题。因此，将使用相同方法纯化的双链RNA溶液进一步用市售的rRNA去除试剂盒进行处理，可将rRNA读数比例减少到20%左右（图1右）。
图1. 肉糜样品中，普通的双链RNA纯化会残留大量rRNA
使用自制核酸纯化柱通过纤维素树脂从肉糜样品中纯化双链RNA。为了阐明rRNA的去除效果，将获得的双链RNA组分进行分组，准备已去除rRNA的样品和未去除rRNA的样品，分别通过FLDS法9）进行测序。通过SortMeRNA软件计算rRNA在清理后的数据中所占的比例。
但是，使用rRNA去除试剂盒会使每个样品的成本增加1万日元左右，处理过程也会变得繁琐且耗时。因此，使用ISOVIRUS Ⅱ（使用纤维素树脂纯化双链RNA用试剂盒， ISOVIRUS的动物样品版）对人肝脏样品进行测试。结果表明，使用ISOVIRUS Ⅱ时，即使不经过rRNA去除工序，也可将rRNA读数比例抑制在20%左右（图2A左）。当ISOVIRUS Ⅱ与rRNA去除试剂盒配合使用时，可进一步降低rRNA读数比例至10%以下（图2A右）。并且，该样品来源为HCV阳性患者，因此也能检测出HCV读数（图2B）。
图2. ISOVIRUS Ⅱ的rRNA残留量少
使用ISOVIRUS Ⅱ通过纤维素树脂从人肝脏样品中纯化双链RNA。为了阐明rRNA的去除效果，将获得的双链RNA组分进行分组，准备已去除rRNA的样品和未去除rRNA的样品，分别通过Modified dsRNA-seq法4）进行测序。通过SortMeRNA软件计算rRNA在清理后的数据中所占的比例，并通过绘图计算HCV的比例。
◆结语
双链RNA作为RNA病毒感染的分子标志物，近50年来一直为提高RNA病毒的探索效率做出贡献。实际上，笔者以前报告的Modified dsRNA-seq方法已成功捕获以极低复制率潜藏在人体器官中的HCV。与采用一般的RNA病毒探索方法相比，检测灵敏度高数百倍，且无需花费巨额测序成本就能全面检测RNA病毒。
直到最近，双链RNA纯化还没有试剂盒化，而是作为每个研究室传承的特殊技术。但是，随着ISOVIRUS系列的推出，它成为了人人都能使用的技术。并且，ISOVIRUS Ⅱ还有望消除昂贵且繁琐的rRNA去除工序，大幅降低从高等动物样品中探索RNA病毒的成本。
在RNA疫苗的生产中，需要去除作为副产物产生的双链RNA，以避免不必要的自然免疫激活10）。ISOVIRUS系列能够稳定地回收可能仅微量存在的HCV来源双链RNA，并且具有数百ng量级的高结合容量，还有望用于上述RNA疫苗的生产。
◆参考文献
1. Morris, T. J. and Dodds, J. A. : Phytopathology, 69, 854 （1979）.
2. Marquez, L. M. et al. : Science, 315, 513 （2007）.
3. Okada, R. et al. : J. Gen. Plant Pathol., 81, 103 （2015）.
4. Izumi, T. et al. : Viruses, 13, 1310 （2021）.
5. Hirai, M. et al. : Microbes Environ., 36, ME20152 （2021）.
6. Roossinck, M. J. et al. : Mol. Ecol., 19 Suppl 1, 81 （2010）.
7. Decker, C. J. et al. : Viruses, 11, 943 （2019）.
8. Yanagisawa, H. et al. : Viruses, 8, 70 （2016）.
9. Urayama, S. et al. : Mol. Ecol. Resour., 18, 1444 （2018）.
10. Rosa, S. S. et al. : Vaccine, 39, 2190 （2021）.
◆注释
双链RNA
两个具有互补序列的RNA分子形成碱基对，具有双螺旋结构的RNA分子。
读数（比例）
指通过新一代测序技术获得的庞大数量的碱基序列之一。在庞大的读数中，表示特定序列所占的百分比时，称为"读数比例"。
HCV
丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus）的简称。多数的慢性感染患者被认为会发展成肝硬化或肝癌。
◆相关产品
双链RNA纯化试剂盒
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产品编号 |
产品名称 |
产品规格 |
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310-08811 |
ISOVIRUS |
20次用 |
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312-09091 |
ISOVIRUS II |
20次用 |