WarmStart® Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

配方中加入温度低于 42℃ 的条件下活性会受到抑制的可逆结合核酸适配体，来源于古生球菌属（Archaeoglobus fulgidus）的 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）可在温度 > 42℃ 的条件下高效催化含尿嘧啶的单链或双链 DNA 释放游离尿嘧啶。

图 1：WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）在温度低于 42℃ 的条件下未检测到活性。

WarmStart® Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG） |
（A）Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）（NEB #M0279）和 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）（NEB #M1282）的 UDG 活性温度曲线比较表明，在温度低于 42℃ 的条件下，WarmStart 的 UDG 活性会受到抑制。将 0.002 U 的 Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）或 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）与 1.8 pmol 荧光标记的且含一个尿嘧啶碱基的 47 mer 单链 DNA 寡核苷酸在不同温度（25 – 65℃）温育 30 分钟，测得 UDG 活性。尿嘧啶切除后，对生成的脱碱基位点进行化学切割（1M NaOH，85℃，10 分钟），然后在 Applied Biosystems 3730xl 基因分析仪（96 通道）上进行毛细管电泳（CE）片段分析。结果表明，虽然 WarmStart 版本的 Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）在 65℃ 时表现出与 Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶相似的活性，但 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）在 25℃ 时未检测到活性。

（B）低温范围（30 – 45℃）内且存在 dUTP 的情况下，使用 WarmStart Afu尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）（上图）、Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）（中图）或不使用 UDG（下图），对 Lambda DNA 的 500 bp 扩增子进行链置换扩增（SDA）。在不使用 UDG 的情况下，SDA 在整个温度范围内产生了一条 500 bp 的条带（下图），但温度 > 31℃ 时，SDA 受到 Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）的完全抑制（中图）。抑制扩增子生成的原因是尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）在低温下的固有活性，它会在含 dU 的扩增子中生成脱碱基位点，从而阻止其进一步扩增。然而，WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）的存在（上图）对含 dU 扩增子的扩增几乎没有影响，只是在 45℃ 左右时产物产量略有下降，这表明 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）在温度 > 42℃ 的条件下具有活性。

图 2：WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）可在 65℃ 时高效酶切含尿嘧啶的扩增产物。

WarmStart® Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG） |

 
（A）使用 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）避免 SDA 扩增后交叉污染的示意图。在不含 UDG 或含有 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）且 dUTP 存在的情况下，在 34℃ 时扩增 500 bp 扩增子，该情况下 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）无活性。SDA 后，将反应在 65℃ 温育 20 分钟，以便在先前引入的 dU 所在位置生成脱碱基位点。然后，在碱性条件下于 85℃ 温育 10 分钟，切割脱碱基位点的 DNA 骨架。

（B）在 65℃ 扩增和处理 20 分钟后，凝胶电泳观察显示，不含 UDG 和含有 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）的样品都有相似的 500 bp 扩增产物产量。然后，在碱性条件下于 85℃ 温育 10 分钟，切割脱碱基位点的 DNA 骨架。化学切割后，在不含 UDG 的反应中，500 bp 产物保持完整，但在含有 WarmStart Afu 尿嘧啶-DNA 糖基酶（UDG）的反应中，500 bp 产物的条带较弱且产物呈弥散状。

产品类别:
DNA Repair Enzymes and Structure-specific Endonucleases Products

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M1282S     -20    
        WarmStart® Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) M1282SVIAL -20 1 x 0.1 ml 2,000 units/ml
        ThermoPol® II (Mg-free) Reaction Buffer B9005SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位指在 1X Thermopol II 缓冲液中，65℃ 条件下，当总反应体积为 50 µl 时，在 30 分钟内，每分钟释放 60 pmol 荧光标记的且含一个尿嘧啶碱基的 47 mer 单链 DNA 寡核苷酸所需的酶量。

    反应条件

    1X ThermoPol® II（不含 Mg2+）反应缓冲液
    Incubate at 65°C

    1X ThermoPol® II（不含 Mg2+）反应缓冲液
    20 mM Tris-HCl
    10 mM (NH4)2SO4
    10 mM KCl
    0.1% Triton® X-100
    (pH 8.8 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    50 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    0.1 mg/ml Recombinant Albumin
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    否

    分子量

    理论上的: 22717 道尔顿

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    单独销售的组分

    • ThermoPol® II (Mg-free) Reaction Buffer Pack

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) (NEB #M1282)

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Activities of DNA Repair Enzymes and Structure-specific Endonucleases
    • DNA Repair Enzymes on Damaged and Non-standard Bases
    • Properties of DNA Repair Enzymes and Structure-specific Endonucleases

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the activity of WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) in NEBuffers?
    2. Will WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) work in Thermopol® Buffer?
    3. What is the molecular weight of WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG)?
    4. Is WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) a tagged protein?
    5. Does the Uracil Glycosylase inhibitor (UGI) inhibit WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG)?
    6. Does WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) release uracil from ss and dsDNA?
    7. Does WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) cut RNA?
    8. Will WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) work in Fpg buffer?
    9. What does WarmStart mean?
    10. How can WarmStart Afu Uracil-DNA Glycosylase (UDG) be used for carryover prevention?
    11. What is Strand Displacement Amplification (SDA)?