LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）包含经过优化后的 5X 预混液，以及 cDNA 第一链合成所需的所有组分（引物除外）。该预混液含有具备热稳定性的 Luna 反转录酶，可在更高温下合成 cDNA。试剂盒还提供小鼠 RNase 抑制剂（保护模板 RNA 免受降解）和 dNTP。此外，组分中的蓝色示踪染料可在反转录和下游应用中起到示踪作用。

该预混液与随机引物、oligo dT 引物以及基因特异性引物兼容，让 cDNA 合成更灵活。LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）合成的 cDNA 产物可用于多种下游应用。在实时定量 PCR 中，建议使用混有随机引物及 oligo dT 的混合引物合成 cDNA。与 LunaScript SuperMix 反转录试剂盒（NEB #E3010）一样，无论是 1 μg 总 RNA 还是低拷贝 RNA，该预混液均能提供稳健、线性和灵敏的检测。如需合成长片段或全长 cDNA，则建议使用 oligo dT 引物。仅需 55℃ 温育 10 分钟，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）即可合成长达 9 kb 的 cDNA 产物。试剂盒还提供 No-RT 对照预混液，可快速建立对照反应体系。

图 1：SuperMix、预混液和 cDNA 合成试剂盒的比较

LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） |

图 2：LunaScript 第一链 cDNA 合成时间最短，仅需 13 分钟

LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） |

不同厂家的 cDNA 合成方案比较。LunaScript SuperMix 反转录试剂盒和 LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）所需反应时间最短，并可以耐受高温，降低了 RNA 复杂二级结构的影响。

图 3：LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）支持多种下游应用

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通过使用不同的引物（例如：随机引物混合液 d（T）23VN 寡核苷酸或随机六聚体引物），LunaScript 反转录预混液试剂盒合成的 cDNA可适于不同下游应用（例如：RT-qPCR、RT-PCR 和 RNA-seq）。

图 4：在两步法 RT-qPCR 定量中，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）功效稳健

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A.使用随机引物混合液（NEB #S1330）和 LunaScript 反转录预混液（无引物）对 1 µg 至 100 pg RNA 进行反转录，并进行两步法 RT-qPCR 检测，结果显示：与 LunaScript（NEB #E3010）一致，合成 cDNA 产量均展现出良好的线性度。

B.对于常规转录本，使用 d（T）23VN 引物获得的 cDNA 覆盖度与随机引物混合液一致。但对于长转录本（例如：SMG1），随机引物混合液能更好地覆盖靶基因 5´ 端，右下角图框所示：RT-qPCR 的靶基因位于 SMG1（16 kb）转录本的 5´ 端；与随机引物混合液（随机六聚体引物和 dT 锚定引物的混合物）相比，单独使用 dT 锚定引物 [d（T）23VN] 的 Cq 值延迟。

图 5：在两步法 RT-qPCR 中，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）性能更优异

LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） |

A.根据各厂商产品说明书，使用几种市售第一链 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA，所用引物为随产品提供的随机引物。通过 8 个靶基因（丰度、长度和 GC 含量不同）的 qPCR 结果对 cDNA 产物进行评估。使用 Luna 通用探针法 qPCR 预混液（NEB #M3004）对 cDNA 产物进行 qPCR 检测。从扩增效率和 ΔCq 方面评估了结果，其中 ΔCq 衡量痕量样本检测和无模板对照（NTC）扩增（ΔCq = NTC 的平均 Cq – 最低起始量的平均 Cq）。绿色框表示目标扩增表现（效率 = 90 – 110%，ΔCq ≥ 3）。关于该可视化分析方法的详细信息，请在 NEB 官网搜索 Development of a high-throughput data analysis method for quantitative real-time PCR (qPCR)。

B.根据上述 4 个靶基因（两个经典内参基因和两个其它基因）的 Cq 值和上样量绘制曲线。结果显示：与其它商品化试剂盒相比，LunaScript 的 Cq 值最低。

图 6：在常规 PCR 或超保真 PCR 中，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）能够合成各种长度范围 cDNA

LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） |

使用 LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）将 1 µg Jurkat 总 RNA 反转录成 cDNA，引物为 d（T）23VN，使用标准反应条件 55℃ 温育 10 分钟，95℃ 温育 1 分钟。之后使用不同 PCR 扩增试剂对 cDNA 合成产物进行检测。对于 5 kb 以内的常规应用，建议使用 OneTaq 2X 预混液（NEB #M0482）。如需高保真度，建议使用 Q5 热启动超保真 2X 预混液（NEB #M0494）。如需长片段 PCR 扩增有较佳产量，建议使用 LongAmp Taq 2X 预混液（NEB #M0287）（数据未显示）。
 
产品类别:
Luna® qPCR & RT-qPCR Products,
RT-PCR Products,
cDNA Synthesis & Reverse Transcriptases Products

应用:
RT-PCR,
cDNA Synthesis,
Reverse Transcription (cDNA Synthesis),

RT-PCR & cDNA Synthesis

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3025S     -20    
         LunaScript® RT Master Mix (Primer-free) M3025SVIAL -20 1 x 0.1 ml 5 X
        No-RT Control Mix (Primer-free) M3026SVIAL -20 1 x 0.1 ml 5 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 1 x 1.5 ml Not Applicable
    • E3025L     -20    
         LunaScript® RT Master Mix (Primer-free) M3025LVIAL -20 1 x 0.4 ml 5 X
        No-RT Control Mix (Primer-free) M3026LVIAL -20 1 x 0.4 ml 5 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 4 x 1.5 ml Not Applicable

  • 优势和特性

    Features

    • 不含引物的混合液可让用户更灵活地选择引物，以达到 cDNA 合成最佳效果
    • 15 分钟内即可完成第一链 cDNA 合成
    • 提供 No-RT 对照预混液，增加实验可信度
     

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    • Monarch® 总 RNA 小量提取试剂盒
    • LunaScript™ 反转录 SuperMix 试剂盒
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • OneTaq® 2X 预混液（提供标准缓冲液）
    • OneTaq® 热启动 2X 预混液（提供 GC 缓冲液）
    • LongAmp® Taq 2X 预混液
    • Luna® 通用 qPCR 预混液
    • Luna® 通用探针法 qPCR 预混液

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. LunaScript RT Master Mix Kit Protocols (NEB #E3025)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3025

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Can I use RNA samples purified from different storage conditions such as RNALater in my LunaScript® cDNA synthesis reactions?
    2. Can I set up my cDNA synthesis reaction at room temperature when using the LunaScript® RT SuperMix?
    3. Can I use LunaScript cDNA products directly in qPCR? How much can I use for detection in a qPCR reaction?
    4. How much RNA template should I use in my LunaScript® cDNA synthesis reactions?
    5. How should I store LunaScript® cDNA products?
    6. How should I choose between a one-step RT-qPCR or two-step RT-qPCR approach?
    7. Should I include a No-Reverse Transcriptase (RT) control reaction when setting up my cDNA synthesis reaction?
    8. What qPCR reagents do you recommend for detection of cDNA products?
    9. Why do I have low cDNA yields?
    10. Will the blue dye in the LunaScript® RT SuperMix interfere with detection?
    11. How do I choose between the first strand cDNA synthesis kits from NEB?
    12. When using LunaScript cDNA products in downstream PCR (i.e., two-step RT-PCR), what volumes and PCR products can be used? 
    13. How do I choose primers for cDNA synthesis using LunaScript RT Master Mix (Primer-free)?
    14. Can I use LunaScript RT Master Mix in RNA-seq workflows?
    15. What temperature should I use for my LunaScript® cDNA synthesis reaction?
    16. How do I choose between Induro Reverse Transcriptase and the different LunaScript and ProtoScript products?
    17. How do I know whether my template RNA is of good quality?

  • 问题解决指南

    • Troubleshooting Guide for LunaScript RT Master Mix (Primer-free) Kit (NEB #E3025)