DNA 聚合酶 I,（Klenow）大片段 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

DNA 聚合酶 I,（Klenow）大片段是大肠杆菌（E. coli）DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，其保留了聚合和 3´→5´核酸外切酶活性，但缺失 5´→3´ 核酸外切酶活性（1）。Klenow 保留了全酶的聚合保真度，且不会降解 5´ 末端。

重点

 

产品来源

大肠杆菌（E. coli）菌株，包含已去除 5´→3´ 核酸外切酶结构域的大肠杆菌（E. coli）polA 基因。

产品类别:
DNA Manipulation Products

应用:
Blunting,
DNA Sequencing,
Polymerases for DNA Manipulation,

RT-PCR & cDNA Synthesis,

PCR

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0210V     -20    
        DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment M0210VVIAL -20 1 x 0.02 ml 5,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0210S     -20    
        DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment M0210SVIAL -20 1 x 0.04 ml 5,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0210L     -20    
        DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment M0210LVIAL -20 1 x 0.2 ml 5,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0210M     -20    
        DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment M0210MVIAL -20 1 x 0.02 ml 50,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位是指在 37℃ 条件下，30 分钟能使 10 nmol 的 dNTP 掺入酸不溶物所需的酶量。

    反应条件

    1X NEBuffer™ 2
    Incubate at 25°C

    1X NEBuffer™ 2
    50 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM DTT
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    25 mM Tris-HCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    75°C for 20 minutes

    分子量

    理论上的: 68000 道尔顿

    5′ – 3′ 核酸外切酶

    No

    3′ – 5′ 核酸外切酶

    Yes

    链置换

    +

    单位活性检测条件

    1X NEBuffer 2、33 μM dNTP（含 [3H]-dTTP）、70 μg/ml 变性鲱鱼精子 DNA。

    错配率

    ~ 18×10-6bases

  • 优势和特性

    应用特性

    • Sanger 双脱氧终止法 DNA 测序（2）
    • 补平 5´ 突出末端以形成平末端（3）
    • 去除 3´ 突出末端以形成平末端（3）
    • 第二链 cDNA 合成
    • 突变方案中的第二链合成（4）

  • 相关产品

    相关产品

    • dNTP 套装
    • dNTP 混合液
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

    单独销售的组分

    • NEBuffer 2

  • 注意事项

    1. 通过去除 3´ 突出末端并补平 3´ 凹陷末端实现末端平齐化的操作步骤：
      • DNA 应溶解在 1X NEBuffer 1 – 4 或 T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，并每种 dNTP 补充 33 μM。每微克 DNA 添加 1 个单位的 DNA 聚合酶 I,（Klenow）大片段，并在 25℃ 条件下温育 15 分钟。通过添加 EDTA 至终浓度为 10 mM，并在 75℃ 条件下加热 20 分钟来终止反应。
      • 注意：由于酶的 3´→5´ 核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入 dNTP 或反应时间过长皆可导致凹陷末端的形成。
    2. Elevated temperatures, excessive amounts of enzyme, failure to supplement with dNTPs or long reaction times may result in recessed ends due to the 3´→ 5´ exonuclease activity of the enzyme.
    3. 在使用 Sanger 等人提出的双脱氧终止法进行 DNA 测序时，DNA 聚合酶 I,（Klenow）大片段的推荐用量为 1 U/5 μl 反应体积。
    4. 补充 dNTP 后，DNA 聚合酶 I，（Klenow）大片段在所有四种 NEBuffer 和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液中均有活性。

  • 参考文献

    1. Jacobsen, H., Klenow, H. and Overgaard-Hansen, K. (1974). Eur. J. Biochem.. 45, 623-627.
    2. Sanger, F. et al. (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467.
    3. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2nd ed.), 5.40-5.43. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
    4. Gubler, U. (1987). In S.L. Berger and A.R. Kimmel(Ed.), Methods in Enzymology. 152, 330-335. San Diego: Academic Press.
    5. Bebenek, K., Joyce, C.M., Fitzgerald, M.P. and Kunkel, T.A. (1990). J. Bio. Chem . 265, 13878-13887.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for blunting ends by 3′ overhang removal and fill-in of 3′ recessed (5′ overhang) ends using DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment (M0210)

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Blunting Selection Chart
    • DNA Polymerase Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBcloner®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Can DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment be used in other NEBuffers, including rCutSmart™?
    2. Can DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment be used to blunt DNA?
    3. Can DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment be used to fill in 3′ overhangs?
    4. Can DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment be used to chew back 5′ overhangs?
    5. Can DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment be heat inactivated?
    6. Are the nucleotides needed to remove a 3′ overhang with DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment?
    7. What are the main causes for blunting reaction failure using DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment?
    8. Can DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment be used in labeling reactions and partial fill in reactions?
    9. Is DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment the enzyme of choice for chewing back 3′ overhangs and filling in 5′ overhangs (3′ recessed ends)?
    10. Are NEB DNA Polymerases supplied with dNTPs?

  • 实验技巧

    酶过量、温度高于 25℃ 或 dNTP 浓度过低会导致 3’→5’ 核酸外切酶过度降解，从而阻碍平末端的形成。