phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒包含了灵敏高效实现滚环扩增（RCA）所需的全部试剂，这是一种等温扩增方法，通过产生环状序列的长重复拷贝来连续扩增环状 DNA。该试剂盒的特点是包含 phi29-XT DNA 聚合酶，该酶是经基因工程改造过的聚合酶，相较于野生型 phi29 DNA 聚合酶，可在更短反应时间内获得高产量的产物，并改善热稳定性和灵敏度。该试剂盒还包含 dNTPs 和核酸外切酶抗性的随机引物（含有硫代磷酸酯键），确保了扩增环状 DNA 序列的通用性。起始材料可以是纯化的环状 DNA（单链或双链），或者直接使用液体培养基培养物、琼脂平板菌落和甘油菌，而不需要额外进行 DNA 提取。RCA 产物可直接用于下游应用，如 DNA 测序、细胞游离 DNA 富集、无细胞蛋白表达和 DNA 生物传感器。

图 1：phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒概述

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒 |

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB #E1603）是一种快速、使用简单、用途广泛的试剂盒，该试剂盒中包含使用随机引物混合物进行滚环扩增（RCA）所需的全部试剂。该试剂盒可从纯化的环状 DNA 或细菌细胞等多种起始样本获得高得率的 DNA 产物。该试剂盒应用广泛，可用于 DNA 测序、细胞游离 DNA 富集、无细胞蛋白表达和 DNA 生物传感器。

图 2：在高温下，相较于野生型 phi29 DNA 聚合酶，phi29-XT DNA 聚合酶在更短的时间内能获得更多的产物

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒 |

以 0.1 pg pUC19 质粒（NEB #N3041）作为起始样本，在指定温度下进行 RCA 反应 2小时，随后在 65℃ 下加热失活 10 分钟，平行重复反应三次。所有反应均含有 1 mM dNTPs 和 50 µM 核酸外切酶抗性随机引物。野生型 phi29 反应使用 10 单位 phi29 DNA 聚合酶（NEB #M0269）、1X phi29 DNA 聚合酶反应缓冲液和 0.1 mg/mL 重组白蛋白，phi29-XT 反应使用 1X phi29-XT DNA 聚合酶和 1X phi29-XT 反应缓冲液。使用 Quant-iT® PicoGreen® dsDNA 试剂测定反应产量（点），并求得平均值（线）以确定各个反应温度下的产量。野生型 phi29 DNA 聚合酶的反应温度在 30℃ 和 37℃ 之间，然而 phi29-XT DNA 聚合酶在 42℃ 能获得更多的产物。

图 3：phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒可有效扩增低至 1 fg 的 pUC19 DNA

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒 |

在无模板（NTC）或使用 1 fg pUC19 质粒的条件下，使用 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB #E1603）在 42℃ 下进行 2 小时的 RCA 反应，平行重复反应四次。使用 AclI（NEB #R0598）消化反应产物，该酶特异性切割质粒序列以产生两个片段（373 bp 和 2,313 bp），并使用琼脂糖凝胶电泳验证扩增成功性。phi29-XT DNA 聚合酶可在 2 小时内高效扩增 1 fg 的 2.7 kb 环状质粒 DNA。

图 4：phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒能显著提高产量和灵敏度

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒 |

使用市售的 phi29 DNA 聚合酶，根据操作说明，以 1 pg 或 1 ng pUC19 质粒作为起始样本，进行 RCA 反应 2 小时，平行重复反应三次。使用 Quant-iT® PicoGreen® dsDNA 试剂测定反应产量（点），并求得平均值（柱）。相较于其它市售产品，phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB#E1603）在更短的时间内能获得更多的产量。

图 5：与传统的质粒制备方法相比，使用 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒进行菌落直扩时，能在更短的时间内实现无细胞蛋白表达

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒 |

A. 挑选携带 pET28a 载体的单个菌落，该载体用于表达含有 T7 启动子的 eGFP，挑选的单菌落用水进行稀释。随后使用 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB #E1603）制备质粒或使用传统液体培养法抽提质粒。

B. 对 RCA 产物（1 µl 20 倍稀释的 RCA 产物）或使用传统液体培养法抽提到的质粒（900 ng）进行 Sanger 测序，结果如图所示。

C. 序列验证后，使用 NEBExpress® 无细胞 E. coli 蛋白合成体系（NEB #E5360）表达 GFP 蛋白。在 10 µl 总反应体系中，使用 2.4 µl 20 倍稀释的 RCA 反应产物或 100 ng 纯化质粒作为模板。通过 eGFP 荧光评估蛋白合成效率，相较于抽提的质粒，RCA 产物能够在更短时间内更高效地实现 GFP 无细胞体外蛋白合成。

产品类别:
Isothermal Amplification & Strand Displacement Products

应用:
Isothermal Amplification

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1603S     -20    
        phi29-XT DNA Polymerase M0572SVIAL -20 1 x 0.2 ml 10 X
        phi29-XT Reaction Buffer B0572SVIAL -20 1 x 1 ml 5 X
        Exonuclease-Resistant Random Primers S1884SVIAL -20 1 x 0.2 ml 500 µM
        Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix N0447SVIAL -20 1 x 0.2 ml 10 mM each dNTP
    • E1603L     -20    
        phi29-XT DNA Polymerase M0572LVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        phi29-XT Reaction Buffer B0572SVIAL -20 2 x 1 ml 5 X
        Exonuclease-Resistant Random Primers S1884LVIAL -20 1 x 1 ml 500 µM
        Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix N0447XVIAL -20 1 x 1 ml 10 mM each dNTP

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocols for amplification of DNA using the phi29-XT RCA Kit (NEB #E1603)
    2. General Protocols for Downstream Applications (NEB #E1603)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE1603

  • 应用实例

    • Accelerating DNA Construction to Protein Expression: A Rapid 1-Day Workflow Using NEBridge® Golden Gate Assembly 

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Polymerase Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the advantage of using phi29-XT DNA Polymerase instead of wild-type phi29?
    2. How can I increase the RCA yield?
    3. At what temperature range can the phi29-XT RCA Kit be used?
    4. Can the phi29-XT RCA Kit be used to generate single-stranded DNA?
    5. Can the phi29-XT RCA Kit be used to amplify large, circular DNA constructs such as BACs and Fosmids?
    6. Does the input DNA template have to be circular?
    7. How can I verify successful amplification and specificity of my RCA reaction?
    8. How can I debranch my RCA products?
    9. Do I need to purify the RCA products prior to downstream applications?
    10. How do I quantify my RCA products?
    11. Can phi29-XT DNA Polymerase be heat inactivated?
    12. Can I use this kit to incorporate 5-methyl-dCTP?
    13. Does phi29-XT DNA Polymerase work in wild-type phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer?
    14. Can phi29-XT DNA Polymerase be used in wild-type phi29 RCA reaction conditions (1X phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer at 30°C)?

质控、安全 & 法规

  • 质控分析

    每一新批次的 NEB 产品都要经过质控，以满足指定的质量标准，对特定产品的质量标准和每一批次的检测数据可以通过产品说明表格、COA、产品信息卡或者产品手册进行查阅或下载。关于 NEB 产品质控的详细信息，可从此处查阅。

  • 产品说明与变更通知

    产品说明表包含产品的储存温度、有效期和规格，这些文件的命名规则如下：[货号]_[规格]_[版本]

    • E1603S_L_v1

  • CoA 文件包含单个批次产品的储存温度、有效期和质控，这些文件的命名规则如下： [货号]_[规格]_[版本]_[Lot#]

    • E1603L_v1_10183353
    • E1603S_v1_10183508
    • E1603S_v1_10190498
    • E1603S_v1_10191379
    • E1603S_v1_10194814
    • E1603S_v1_10198092
    • E1603L_v1_10202800
    • E1603L_v1_10212167
    • E1603S_v1_10213283
    • E1603S_v1_10221689
    • E1603S_v1_10234116

  • SDS

    以下 SDS 文件可以帮助您安全地使用该产品

    • phi29-XT DNA Polymerase
    • phi29-XT Reaction Buffer
    • Exonuclease-Resistant Random Primers
    • dNTP 混合液

  • 法律 & 免责声明

    产品及内容受 New England Biolabs, Inc（NEB）所拥有或控制的一项或多项专利、商标和/或版权保护。文中使用商标符号并不一定表明其在出现的国家/地区注册为商标，仅表明已在创始地注册。如将本产品用于特定应用，用户可能需要获取第三方知识产权授权许可。了解更多信息，请邮件咨询 [email protected]。

    本产品仅用于科研。本产品不适用于人类或动物的治疗或诊断。

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