在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂

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      FDV-0032

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)Controllable NOdonor<NO-Rosa5>

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO的试剂

     

     

    Controllable NOdonor<NO-Rosa5>是通过黄绿色可视光(530~590 nm)的照射释放出1氧化氮(Nitric oxide,NO)的Photo-controllable NO donor。利用光毒性低的可视光照射可以在时间空间上控制NO的释放,有利于各种细胞内信号传输相关的NO生理现象研究。

     

    ※本产品仅供科研使用。

    ※本产品基于名古屋市立大学的中川秀彦教授的研究成果商品化而成。

     

    ◆Memo

    关于NO研究中Photo-controllable NO donor的意义及问题点

    虽然1氧化氮是分子量仅有30的气体分子,但是在生物体内作为信号传输物质而发挥作用,因此阐明其生理意义是一项重要的课题。下文阐述了一些与NO研究相关的生理现象。

    ● 血管舒张(vasodilation)

    ● 神经传输(neurotransmission)

    ● 血小板黏附(platelet adhesion)

    ● 炎症反应(inflammation)

    NO的气体分子是通过生物体内的NO合成酶产生,但在生理条件下极其不稳定,半衰期约为几秒左右。因此,NO被认为是在生物体内产生后,仅在非常狭小的范围(<100 μm)内起作用的局部信号传输物质,因此,期待能够阐明NO作为媒介参与的局部信号传输的意义。然而,由于NO是不稳定的气体分子,难以用于实验中,于是NO donor便被用于验证NO生理效果。

    NO donor是在水溶液中分解,并缓慢释放NO的化合物群的总称。不同NO释放效率以及半衰期各异的化合物被开发成各种产品。然而,使用以前的NO释放剂,会使实验溶液全部均一地释放出NO,导致很难观察到原来的NO作用于局部的瞬时效果。为了解决该问题,近年来已开发出几种光反应性的NO donor如“Photo-controllable NO donor”,1) 需要UV光的试剂类,或2) 主要使用金属络合物的试剂类,但无论哪种都有难以适用于活细胞实验的缺点(参照表格)。

    名古屋市立大学的中川秀彦教授等人克服了至今的问题,成功开发出不含金属络合物,毒性低且能在时间空间上控制NO释放,并通过可视光控制的Photo-controllable NO donor——NO-Rosa5(Controllable NOdonor)。使用本产品,可以在任意时间以及任意局部控制NO释放,作为研究NO的新工具而备受期待。

     

     

    普通NO donor

    Photo-controllable NO donor

    UV光控型
        CNO-4,BNN5等

    金属络合物

    Controllable Nodonor
        (NO-Rosa5)

    NO释放原理

    自发性分解

    光分解后自发分解

    光分解

    光分解

    光照

    ——

    UV光

    可视光、近红外光

    可视光

    (~300 nm)

    (530~590   nm)

    时间控制

    困难

    可以

    可以

    可以

    空间控制

    不可以

    可以

    可以

    可以

    光毒性

    ——

    毒性极高

    毒性低

    毒性低

    化合物的细胞毒性

    与化合物有关

    (金属毒性)

     

    ◆参考文献

    1. 

    Ieda, et al., Sci. Rep.9, 1430, (2019) ,"Structure-efficiency relationship of photoinduced electron transfer-triggered nitric oxide releasers."

     

    2. 

    Ieda, et al., Chem. Pharm. Bull.67, 576~579 (2019), "In cellullo and ex vivo availability of yellowish-green-light-controllable NO releaser."

     

    3. 

    Okuno, et al., Org. Biomol. Chem.15, 2791~2796 (2017), "A yellowish-green-light-controllable nitric oxide donor based on N-nitrosoaminophenol applicable for photocontrolled vasodilation."

     

    ◆原理

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

    本试剂将Rosamine色素骨架用作光吸收天线,在吸收黄绿色光(530~590 nm)时,诱导光致电子转移(PeT: Photoinduced electron Transfer),释放出NO。

     

    ◆特点

    ● 通过黄绿色光(530~590 nm;最大吸收λmax~560 nm)引发NO释放。

    ● 非光照射时,NO释放量被抑制在极其微小的程度*1 

    ● 推荐使用浓度10 μM,未发现细胞毒性。

    ● 已验证了在培养细胞系,ex vivo主动脉血管舒张实验中的生物活性。

    ● 已证实显微镜的543 nm射线(He- Ne射线)以及氙灯可作为光源使用。

    *1 请务必注意实验中的环境光线。

     

    ◆操作方法概要

    ※以下实验步骤仅供参考。请根据具体实验目的进行探讨。

    1. 制备含有Controllable NOdonor的培养基

    2. 去除培养基

    3. 更换含有Controllable NOdonor的培养基*2

    4. 培养30分钟以上

    5. 在任意时间、部位进行光照,然后进行各种成像*3 或生化学分析

    *2 也可不更换培养基,直接添加Controllable NOdonor。

    *3 各种成像中使用荧光物质作为检测系统时,需要注意荧光物质的选择。详见下文中的“实验指导”。

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

    实验注意

    本产品有可能因实验环境的光线(室内荧光灯或阳光)分解,释放出NO。在制备溶液以及进行实验时尽量保持避光。

     

    ◆应用实例

     ■ 通过NO电极定量NO释放活性

    作为in vivo NO释放模型,用黄绿色光(530~590 nm带通滤波器)照射含10 μM Controllable NOdonor、100 mM HEPES(pH7.3)、0.1% DMSO的溶液,通过NO电极定量释放的游离NO浓度。连续300秒照射时,最大可观察到4 μM的NO(左)。照射时间每20秒脉冲一次时,则可观察到阶段性的NO释放。随着试剂消耗,NO的释放量也逐渐减少(右)。

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     ■ 使用NO检测试剂实现NO释放活性可视化

    用绿色荧光NO检测试剂DAF-FM(10 μM)前处理HEK293T细胞30分钟后,用PBS清洗细胞,在添加Controllable NOdonor的条件下培养30分钟。使用NO检测试剂DAF-FM的荧光强度观察氙气光源(带通滤波器 530~590 nm)照射前后细胞内的NO量。由于光照后DAF-FM的荧光强度显著增强,可以看出通过光照促使NO释放。

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

     ■ 通过局部的光照使特定部位释放NO

    用荧光NO检测试剂DAF-FM DA(10 μM)前处理HEK293T细胞30分钟后,用PBS清洗细胞,在添加Controllable NOdonor的条件下培养60分钟。使用共聚焦显微镜的543 nm射线光照白圈部分(直径31 μm),通过DAF-FM检测NO的释放。可以确认仅白圈部分释放出NO。使用本试剂,可通过光在时间空间上控制NO的释放。

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

     ■ ex vivo 血管舒张实验

    将分离的大鼠主动脉切片浸于填满Krebs缓冲液的Magnus 试管中,并添加抑制内源性NO产生的NO合成酶抑制剂L-NAME(100 μM)。接着,添加去甲肾上.腺素(10 μM)使血管进入收缩状态。即使用绿光(530~590 nm)照射3分钟,也未发现光自身对血管收缩有效果(图中①)。但添加Controllable NOdonor(10 μM)后照射绿光则可观察到明显的血管舒张(图中②④)。停止光照后,再次发现血管收缩(图中③⑤)。虽然sGC(soluble guanylyl cyclase)-cGMP路径参与NO引起的血管舒张,但在该状态下添加sGC抑制剂ODQ(10 μM)的话,绿光照射也能抑制血管扩张(图中⑥)。实验结果可以看出使用Controllable NOdonor通过光照能够控制血管舒张。

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

     ■ 评价细胞毒性

    向HEK293T细胞中分别添加10(推荐浓度)、30、100 μM的Controllable NOdonor并培养48小时后,使用WST-8分析评价细胞存活率。30 μM以下的细胞存活率得以维持,但在高浓度的100 μM中发现了细胞毒性。本试剂推荐使用10 μM。

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

    ◆实验指导

    光谱信息

    Controllable NOdonor拥有下图所示的吸收和荧光光谱。530~590 nm的光照可以有效地释放出NO。另外,由于含有Rosamine骨架,请注意在500~600 nm的光照下激发,会观察到红色荧光。

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

    在任意范围、时间通过可视光照射释放NO(Nitric oxide)的试剂(和光纯药工业株式会社)

     

    荧光染料选择指导

    由于Controllable NOdonor在500~600 nm光照下会释放NO,在实验中同时使用荧光物质(荧光色素,荧光检测试剂,荧光蛋白等)时,请务必注意以下几点。建议提前探讨Controllable NOdonor的荧光特性是否会影响目的荧光物质的观察。

     

    (1)避免使用红色荧光物质

    原因如下,在500~600 nm范围内不推荐使用含有激发波长的红色荧光物质。

    1. 通过激发光的照射,诱导Controllable NOdonor的NO释放。

    2. 观察到Controllable NOdonor的Rosamine骨架来源的荧光。

     

    (2)可同时使用的荧光物质

    以下波长范围的荧光物质可以与Controllable NOdonor同时使用。

    激发波长<500 nm的荧光物质(蓝色荧光物质或绿色荧光物质等)

    激发波长>600 nm的近红外荧光物质

     

    ※确认NO的释放推荐使用绿色荧光NO检测试剂DAF-FM DA

    ◆产品列表

    产品编号 产品名称 包装
    FDV-0032 Controllable NOdonor<NO-Rosa5> 0.25 mg
    温馨提示:不可用于临床治疗。

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