东京大学医学部附属医院 整形外科脊椎外科 第2研究室 河源 元

1.前言

　　检测相关细胞的生理活性是掌握生物体骨代谢状态的有效方法。骨组织使用碱性磷酸酶（ALP）进行染色可明确成骨细胞的成骨潜能，使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色可明确破骨细胞的骨吸收能力。并且在同一切片上进行二重染色时，可同时识别二者。另外，本产品还具有使用脱钙标本进行二重染色实验，无需特殊机器，在一般的设施上即可观察骨代谢等特点。在这样的背景下进行二重染色的研究。

2.标准标本的制作

　　用之前使用的树脂包埋法或冷冻切片法制成的标本作为标准标本，和脱钙石蜡切片相比。即酒精固定小鼠肘关节，用乙二醇甲基丙烯酸树脂包埋，硬组织切片机制作2μｍ切片，然后进行TRAP和ALP染色（图1）2）。再制作脱钙冷冻切片（图2）作为标准标本。然后，研究或改良固定、脱钙、染色等各阶段双重染色的可行性。

图3.本实验标准标本——小鼠肘关节染色标本。 左图为TRAP染色，右图为ALP染色。下图是二者的双重染色。 染色效果均佳。以此作为阳性对照，与脱钙石蜡切片一起染色，进行染色性评估。

图2.脱钙冷冻切片酶染色—将柠檬酸脱钙的小鼠腰椎 和右上肢浸泡在30%蔗糖溶液，后经OCT复合包埋， Tissue‐tekPINO冻结，Cryo3制作5μｍ冷冻切片。再对切片进行酶染色。 不仅可进行TRAP染色（左：红色）和ALP染色（中：褐色）的单染色，双重染色（右）也呈阳性。

3.固定

　　ALP染色使用不能用福尔马林固定的新鲜材料，如果未在短时间内固定，会导致酶失活，因此推荐80%乙醇固定。①小鼠膝关节不进行一次固定，直接用乙醇直接浸泡进行二次固定组。②小鼠腰椎用福尔马林（4% Paraformaldehyde Fix Solution）固定16小时后再用乙醇进行二次固定。③小鼠腰椎用福尔马林固定4天后进行二次固定。④临床案例也用福尔马林固定1个月后，再进行二次固定。对上述四种类型进行TRAP·ALP双重染色，研究染色的可行性。图3是各染色性的研究结果。本实验证明福尔马林固定从16小时到4天时间范围内均可进行TRAP·ALP双重染色。

图3.福尔马林的1次固定的固定时间和TRAP/ALP的染色性研究 ①是未经福尔马林固定，仅用酒精2次固定的样品，ALP染色呈强阳性。TRAP染色呈阴性。 ②是福尔马林固定16小时和③是固定4天，TRAP/ALP的染色效果均佳。 并且，福尔马林固定1个月的临床案例（骨软骨瘤）中TRAP染色呈阳性，但不能ALP染色。

4.脱钙

　　ALP酶是含有金属Zn蛋白。通过脱钙处理，酶的组成成分Zn被去除，导致酶失活。为弥补此缺点，需要添加ZnSO₄，作为ALP活化剂。换言之，100mL脱钙液需添加0.4mL  1%ZnSO₄，来补充Zn离子。并且，作为脱钙剂，在柠檬酸盐酸缓冲液添加Zn的同时，也可尝试添加相同螯合剂EDTA溶液进行研究。另外，也可研究能否在酸性脱钙剂（甲酸福尔马木木溶液）进行酶反应。结果显示，脱钙液添加EDTA溶液后染色良好。反之，甲酸福尔马木木溶液不能进行酶染色（图4）。脱钙方法利用超声波脱钙装置（Histra-DC，正常光）在8~16℃的低温环境下，连续操作3-6天，对样品进行脱钙处理。脱钙后用添加甘氨酸的Barbital缓冲液（pH7.4）清洗，磷酸钙附着在组织上，防止沉淀。

图4.脱钙液的种类不同可否双重染色 左图是选用酸性脱钙溶液中对组织伤害较少的甲酸福尔马林 脱钙溶液脱钙3天（Histra-DC,8～16℃）后的大鼠膝关节。 （Histra-DC，8-16℃）TRAP和ALP均不能染色。相对来说，中图、右图均可进行TRAP/ALP双重染色。

5.染色

　　染色法是Lorch的Gomori法。本次用的是偶氮染料法和耦合法结合的TRAP/ALP染色试剂盒（Wako，产品编号：294-67001）。Lorch推荐切片厚度为8μm，同时也研究了普通的4μm切片是否能染色、双重染色的顺序应该先染TRAP和ALP中的哪一个、封片剂是否必须选水溶性封片剂等问题。

　　染色法结果：偶氮染料法中切片过厚导致酶扩散图像。即用TRAP染色骨质有红染倾向，但即使是4μm厚度，只要增强反应条件（反应温度和反应时间），也能充分染色的。换言之，TRAP染色中反应温度从室温调至37℃，反应时间从30分钟调至45分钟或60分钟。ALP染色在37℃反应45分钟至3小时，或者室温（10-15℃）下反应时间增加至一晚。此结果显示，两者色调平衡，染色效果好（图5）。但是，反应条件的增强导致ALP染色切片产生了很多色素颗粒（图2）。另外，TRAP和ALP的染色顺序哪一个先染色都是可以的。如果先进行ALP染色时，在TRAP阳性部位呈明显的红色，鲜艳处为破骨细胞。获得比较好的标本。但是，ALP的反应产物经过TRAP溶液处理后，会产生白色混浊颗粒，沉淀在组织上。因此，先TRAP染色，接着ALP染色的方法是可行的。封装法是利用甲基绿数秒间核染色处理。水洗后，37℃下干燥，二甲苯浸透，用马里醇(Marinol)永久封存。有文章推荐在浸透前用推荐使用酒精脱水，但是会产生反应产物的溶解、扩散。

图5.脱钙石蜡包埋切片的TRAP/ALP双重染色 用1年龄小鼠腰椎的EDTA脱钙石蜡切片，进行TRAP/ALP双重染色。 TRAP阳性将破骨细胞染成红色，ALP阳性将细胞活性强的细胞（成骨细胞、软骨细胞）染成褐色。 （上：弱扩大，下：强扩大）

6.总结

　　TRAP和ALP的双酶染色实验中通过对固定、脱钙、染色进行多处改良，实现了对脱钙石蜡标本的染色。但是酶扩散图像对TRAP染色的效果极佳。出于各种原因的考虑，关于固定步骤的影响，如果固定不充分的话，容易抑制脱钙水平。进而导致酶扩散的发生。另外，注意脱钙本身的影响也是有必要的。总而言之，和非脱钙标本相比较，脱钙标本的扩散图像更加明显。脱钙会是酶扩散变强。另外，我们将在今后对切片的厚度和二重染色顺序的影响进行着重研究。

7.产品列表

【参考文献】

[1]　須田立雄、小澤英浩、高橋栄明著:「骨の科学」（医歯薬出版）（1985）.

[2]　河原元：技術講座、続・病理組織標本作製完全マニュアルシリーズ第２回硬組織検査法，

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[3]　「骨形態計測ハンドブック」第１版，p.67（1983）

[4]　末吉徳芳ら：技術講座、組織固定法—より良い固定を目指して，MedicalTechnology，

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[5]　Localization of AlkalinePhosphatase in MammalianBones by I. JOANLORCH

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[8]　Barka,T.and Anderson,P..:J.Histochem.Cytochem.10,741(1962)

[9]　影山圭三、渡辺陽之輔：「病理組織標本の作り方」，慶応義塾大学医学部病理学教室編，

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