Phos-tag™ 实验设计

◆  研究领域

　　

     磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究

◆  Phos-tag™ 的简介

　　Phos-tag^™（Phosphate-binding tag）是由日本广岛大学的Kinoshita等研制的磷酸化蛋白蛋白捕获分子。Phos-tag^™ 螯合Zn²⁺或者Mn²⁺等重金属离子后形成一个半封闭的空间。在pH值6~8的中性条件下，该空间恰好能容纳一个磷酸基团，使得螯合有金属离子的Phos-tag^™ 分子能够与磷酸基团牢固而稳定的结合。可以特异性结合所有氨基酸的磷酸化基团，广泛运用于细菌，酵母，昆虫等物种研究。

 

◆  Phos-tag™ 系列产品

　　利用螯合有金属离子的Phos-tag^™ 可以特异性结合磷酸化基团的特点，研发了Phos-tag^™ 系列产品，运用于常见的蛋白实验，比如SDS-PAGE，免疫印迹，亲和层析，质谱等。

 

Phos-tag™ 系列产品	产品描述	用途	具体运用实验
Phos-tag™ Acrylamide	Phos-tag™ 与丙烯酰胺（Acrylamide，SDS-PAGE分离胶主要成分)结合	分离磷酸化和非磷酸化蛋白。SDS-PAGE分离胶制备中添加金属离子（Zn2+或者Mn2+）和Phos-tag™ Acrylamide。在蛋白电泳过程中，磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tag™ Acrylamide发生特异性结合，导致磷酸化蛋白的迁移速度变慢。	SDS-PAGE（单一蛋白） 免疫印迹（多种蛋白混合液，例如细胞裂解液，组织均浆液，体外激酶反应体系。使用目的蛋白的非磷酸化抗体作为一抗）
Phos-tag™ Biotin	Phos-tag™ 与生物素（Biotin）结合	可与亲和素标记的HRP结合，检测磷酸化蛋白。	免疫印迹（正常SDS-PAGE）
Phos-tag™  Agarose	Phos-tag™ 与琼脂糖（Agarose）结合	利用磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tag™ Agarose特异性结合，纯化磷酸化蛋白。	亲和层析法
Phos-tag™ Mass Analytical kit	Phos-tag™ 与不同荷质比的Zn结合	检测微量磷酸化蛋白和磷酸化多肽。	质谱实验

 

备注：除Phos-tag^™ Mass Analytical kit之外，其他Phos-tag^™ 系列产品都需要配置金属离子溶液。

◆具体实例

1. 体外激酶反应，激酶和底物都带有标签，反应后亲和层析法纯化获得激酶和底物，如何检测底物的磷酸化情况？

　　如果底物和激酶分子量差别大，通过正常的SDS-PAGE能够区分，建议使用Phos-tag^™ Biotin。将激酶和底物进行免疫印迹实验，用Phos-tag^™ Biotin作为抗体检测底物的磷酸化基团（需记录底物的条带位置）。可通过剥离（strip）方式剥离Phos-tag^™ Biotin，用底物的非磷酸化抗体进一步验证其位置。

　　如果底物和激酶分子量差别不大，可进行Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE实验,然后转膜，用底物的非磷酸化抗体检测（没有使用激酶的抗体，所以检测不到激酶的带）。在Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物发生分离，用底物的非磷酸化抗体可以检测所有底物。免疫印迹实验后，观察所有的条带，非磷酸化底物由于没有和Mn2+-Phos-tag^™ Acrylamide结合，所以迁移速度较快，磷酸化底物则迁移速度变慢。通过迁移率的变化，分析磷酸化底物的含量。

 

备注：

1） Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE实验中，建议使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-

       23221），该产品中含有磷酸化和非磷酸化的α-Casein，确保试剂和实验条件能够分离磷酸化蛋白。

2）如果没有非磷酸化底物，可使用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）对底物进行去磷酸

     化反应。

 

2. 如何检测EGF（表皮生长因子）刺激后细胞内MAPK的磷酸化水平？

 　　收集EGF刺激的细胞，制备细胞裂解液作为样品。进行正常的SDS-PAGE实验和Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE实验，转膜后用MAPK的非磷酸化抗体作为一抗进行检测（检测所有的MAPK，包括磷酸化和非磷酸化）。正常SDS-PAGE实验中，磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK没有分离，而在Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE实验中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK发生分离，所以转膜后，用MAPK抗体检测，可以看到分离的条带。比较正常的SDS-PAGE用MAPK抗体的免疫印迹实验和Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE用MAOK抗体的免疫印迹实验，多出来的条带就是磷酸化的MAPK。

 

备注：该实验的前提是EGF刺激后细胞内的MAPK发生磷酸化，细胞内包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后细

          胞内不含有磷酸化的MAPK，则无法用Phos-tag^™ Acrylamide分离磷酸化和非磷酸化MAPK。

 

 

3. 研究蛋白相互作用的实验中，构建带有不同标签的2种融合蛋白，共转染细胞，在细胞内发生磷酸化反应。通过不同标

    签的亲和层析柱获得纯化的蛋白，是否可用Phos-tag^™ Agarose纯化，进行后续免疫共沉淀实验（Co-IP）实验？

 　　Phos-tag^™ Agarose纯化磷酸化蛋白，采用高盐的洗脱方式，没有使用界面活性剂、还原剂、酸或者碱洗脱，蛋白不发生变性，可进行后续的Co-IP实验。

 

 

4. 检测的样品中含有两种磷酸化的蛋白，分子量很接近，如何使用Phos-tag^™ 产品检测磷酸化？

 　　如果样品中两种磷酸化蛋白的分子量很接近，通过正常的SDS-PAGE实验无法区分，建议使用Phos-tag^™ Acrylamide。进行Mn²⁺-Phos-tag^™ SDS-PAGE实验后用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测。

　　也可以使用Phos-tag^™ Biotin。进行正常SDS-PAGE实验后，先用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测，剥离（strip）后用Phos-tag^™ Biotin。如果磷酸化蛋白量少的话，剥离（strip）会去除一些蛋白，可能会影响检测的效果。

 

 

5. 使用Phos-tag^™ Mass Analytical kit，样品中如果含有磷酸缓冲液是否有影响？

 　　该试剂盒检测磷酸化蛋白和多肽的灵敏度较高，样品中含有的磷酸缓冲液会影响磷酸化蛋白与Phos-tag^™ 结合。

 

 

       Phos-tag 系列产品： http://www.boppard.cn/product/listshow/66.html
       相关使用Q&A：http://www.boppard.cn/product/show/56.html