Rapid 快速 PNGase F |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Rapid 快速 PNGase F |

目前，越来越多的抗体和抗体融合蛋白被用于生物治疗。在 IgG 中，Fc 区 Asn297 处的保守 N-糖链对其功能活性至关重要。此外，一些抗体还具有额外的 N-糖链，与 Fc 区 Asn297 处的保守位点一起影响抗体的识别、半衰期和免疫反应。

然而抗体糖基化是异质的，细胞培养过程中的各种变量都可能导致糖链多样性增加。 因此，在生产过程中监测糖蛋白的糖基化状态对于获得正确的糖蛋白形式至关重要。

PNGase F 是去除糖蛋白中几乎所有 N-连接寡糖的最有效的酶促方法。PNGase F 可将天冬酰胺残基脱氨基为天冬氨酸，从而切出完整的寡糖，后者可用于进一步分析。

尽量在最短时间内获得准确的 N-糖链糖谱对于高效的过程监控至关重要。通常情况下，PNGase F 需要进行几个小时的温育才能水解释放的抗体 N-糖链，然后进行糖链衍生化，并通过液相色谱和/或质谱对后者进行分析。此外，不完全的去糖基化可能导致结果出现偏差。有些糖链比其它糖链更易去除，因此除非完全去糖基化，否则获得的糖谱无法表征治疗性抗体的正确组成。

Rapid 快速 PNGase F 是一种经过优化的重组试剂，可在几分钟之内迅速将抗体和融合蛋白完全去糖基化。此酶能够迅速且无偏嗜性地去除所有的 N-糖链，并且可直接进行下游的色谱或质谱分析。Rapid 快速 PNGase F 简化了实验流程，可在保证灵敏度和重复性的前提下减少实验时间。

图 1：IgG 和 IgG 融合蛋白可能的结构
Rapid 快速 PNGase F |
抗体经 Rapid 快速 PNGase F 处理前后的 ESI-TOF 分析结果Rapid 快速 PNGase F |

特异性

Rapid 快速 PNGase F 可从抗体及其相关蛋白上去除所有复合型、杂合型及高甘露糖型糖链（1）。如果核心结构上有 α1-3 岩藻糖（经常出现于植物及昆虫细胞中表达的免疫球蛋白上），PNGase F 及 Rapid 快速 PNGase F 都无法进行切割。

Rapid 快速 PNGase F |

产品类别:
Endoglycosidases Products,
Proteome Analysis Products

应用:
Expression Systems,
Glycan Sequencing,
Recombinant Glycoprotein Expression,

Glycoprotein Analysis

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • P0710S     4    
        Rapid™ PNGase F P0710SVIAL 4 1 x 0.05 ml 50 reactions
        Rapid PNGase F Buffer B0718SVIAL 4 1 x 0.2 ml 5 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X Rapid 快速 PNGase F 缓冲液
    Incubate at 50°C

    热失活

    75°C for 10 minutes

  • 优势和特性

    应用特性

    Rapid 快速 PNGase F 是一种经过优化的重组试剂，可在几分钟之内迅速将抗体和融合蛋白完全去糖基化。此酶能够迅速且无偏嗜性地去除所有的 N-糖链，产物可直接进行下游的色谱或质谱分析。

    使用多种治疗性单克隆抗体来验证 Rapid 快速 PNGase F：不同亚类（IgG 1 至 4）、同型抗体（IgA、IgM、IgE）、生物体（小鼠、人和人源化的）、来源（CHO、小鼠骨髓瘤）和结构（IgG、IgG 融合蛋白）。

    Rapid 快速 PNGase F 可有效去除保守（即 Fc 区 Asn297 处）和非保守（即 Fab N-糖链）糖基化位点中的所有 N-糖链。基于公开数据进行验证。使用 Rapid 快速 PNGase F 可实现更快、更方便的糖蛋白表征实验流程，并且不会影响灵敏度和特异性。

  • 相关产品

    相关产品

    • Endo S
    • Trypsin-ultra™, Mass Spectrometry Grade
    • IdeZ Protease (IgG-specific)
    • p6043-rapid-pngase-f-antibody-standard
    • p0711-rapid-pngase-f-non-reducing-format

  • 注意事项

    1. 贮存条件：建议将试剂盒贮存于 4℃。如贮存得当，所有组份可保持稳定至少一年。请勿冻存。

  • 参考文献

    1. Maley, F. et al. (1989). Anal. Biochem. 180, 195-204.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Rapid PNGase F Protocols (P0710)
    2. Rapid PNGase F by SDS-PAGE Protocol (P0710)
    3. Intact Protein LS-ESI-TOF Protocol (P0710)
    4. Glycoproteomics: Buffer Exchange Protocols (P0710)
    5. Glycan SPE C18 and Graphitized Carbon Protocols (P0710)

  • 应用实例

    • AppNote_Unbiased_and_Fast_IgG_Deglycosylation _for_Accurate_N-glycan_Analysis_using_Rapid_PNGase_F
    • AppNote_Glycan_Analysis_of_Murine_IgG2a_by_Enzymatic_Digestion_with_PNGase_F_and_Trypsin
    • AppNote_Proteomics_Fast_and_Efficient_Antibody_Deglycosylation_using_Rapid_PNGase_F
    • Glycan Analysis of Murine IgG2a by Enzymatic Digestion with PNGase F and Trypsin, Followed by Mass Spectrometric Analysis
    • Using Glycosidases to Remove, Trim, or Modify Glycans on Therapeutic Proteins
    • Detailed Characterization of Antibody Glycan Structure using the N-Glycan Sequencing Kit

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Endoglycosidase Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the difference between Rapid PNGase F and Endo S (Endo S, NEB# P0741)?
    2. What is the difference between Rapid PNGase F and PNGase F?
    3. What are the components of Rapid PNGase F?
    4. What are the typical reaction conditions for Rapid PNGase F?
    5. How do I know whether to follow the “One Step” or the “Two Step” protocol?
    6. How much Rapid PNGase F should I use to deglycosylate my antibody sample?
    7. What buffers or additives should be avoided when using Rapid PNGase F?
    8. How can I test whether the Rapid PNGase F reaction is complete in 10 minutes?
    9. Are downstream analysis such as HPLC and Mass Spectrometry compatible with Rapid PNGase F?
    10. Is Rapid PNGase F only suitable for deglycosylation of antibodies?
    11. Are longer incubation times detrimental to the Rapid PNGase F reaction?
    12. What is the reaction temperature range for Rapid PNGase F?
    13. What happens to the asparagine residue after Rapid PNGase F removes the sugar?
    14. Will a Rapid PNGase F reaction preserve the integrity of glycosylamines?
    15. Can a protease inhibitor cocktail be used in a Rapid PNGase F reaction?
    16. What is a good control substrate for Rapid PNGase F?

  • 实验技巧

    • 加入 Rapid 快速 PNGase F 之前，确保溶液包含所有组份。
    • 温育前，确保快速缓冲液、IgG 和 Rapid 快速 PNGase F 已正确混匀。
    • 可根据需要调整 Rapid 快速 PNGase F 用量，增加或减少反应体积。改变反应体系中的组份比例会影响结果（例如，在更大的反应体系中仅使用 1 ul 酶）。
    • 可在室温下配制高通量反应体系。温度升至 50℃ 时，去糖基化反应启动。
    • 通常情况下，在 50℃ 条件下，只需 3-5 分钟即可完成反应。温育时间超过 15 分钟不会进一步提高去糖基化效果。如果仍未完全去糖基化，请尝试两步操作流程（在 80℃ 条件下预变性）。
    • 如果去糖基化后需要使 Rapid 快速 PNGase F 失活，请在 70℃ 条件下加热 20 分钟。温度较高可能会导致目标抗体凝固。
    • 避免使用含 SDS 的缓冲液，因为 SDS 会抑制 PNGase F。常用的稳定剂（如 Tween、Triton X-100、NP-40、辛基葡萄糖苷和非去垢剂磺基甜菜碱），以及痕量有机溶剂可能会使去糖基化无法达到最佳效果。