PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译体系，用于基因快速表达分析，是由大肠杆菌翻译所必需组份纯化而构成。PURExpress 体系无核酸酶和蛋白酶的污染，保护了 DNA 和 RNA模板/复合体，避免了蛋白的修饰及降解。转录和翻译过程仅需将两管试剂混合，一步反应即可完成，几个小时内即可获得实验结果，PURExpress 体系大大地节省了宝贵的实验时间，是用于高通量技术的理想选择。

PURExpress 文献引用

图 1：使用 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒的表达蛋白 PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒 |
在 25 μl 反应体系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 单位 RNase 抑制剂，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液使用 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB# P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
图 2：添加 35S-甲硫氨酸通过放射自显影显示蛋白 PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒 |
在 25 μl 反应中加入 250 ng 模板 DNA、20 单位 RNase 抑制剂以及 2 μl 35S-甲硫氨酸，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液进行 SDS-PAGE 电泳分析，将凝胶固定 10 分钟，80℃干燥 2 小时，并在 -80℃ 条件下使用 x 射线胶片曝光 5 小时。
图 3：使用 PURExpress 体系进行蛋白合成和纯化示意图PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒 |
图 4：使用 PURExpress 体系表达和反向纯化 DHFR（A）和 T4 DNA 连接酶（B） PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒 |
根据随附产品说明书中的建议，使用 125 μl 的反应体系。样本使用经考马斯亮蓝染色的 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行分析。在这两种情况下，目的蛋白都可以在总蛋白质的条带中可见。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。

重点

  • 洁净的体系 – 排除了样本降解
  • 使用方便 – 约两小时即可完成蛋白表达
  • 分析简单 – 合成的蛋白经考马斯亮蓝染色在凝胶直观可见
产品类别:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression,
Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3313S     -80    
        Solution A (E3313) B0231AVIAL -80 1 x 0.1 ml 2.5 X
        Factor Mix (30 μl) P0762AVIAL -80 1 x 0.03 ml Not Applicable
        E. coli Ribosome P0763AVIAL -80 1 x 0.01 ml 13.3 µM
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    一般条件：37℃温育

    标记：35S-甲硫氨酸（建议 > 1000 Ci/mmol，体外翻译级）

    TCA 沉淀：TCA 溶液（25%、10%）、1 M NaOH、酪胺酸、乙醇、玻璃纤维过滤器、真空过滤歧管
     
    SDS-PAGE：凝胶和电泳缓冲液、凝胶装置、电源、凝胶干燥器

    蛋白免疫印迹法：转移装置、膜、抗体和检测试剂

    纯化：Ni-NTA 琼脂糖、Amicon Ultra- 0.5 ml、Ultracel- 100K 膜离心过滤器

  • 优势和特性

    应用特性

    • 快速合成用于蛋白质特性研究的分析量级别的样本
    • 确认开放阅读框
    • 检测突变对 ORF 的影响
    • 合成具有活性和功能域的截短蛋白
    • 掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸
    • 绘制抗原表位图谱
    • 毒性蛋白表达
    • 核糖体展示
    • 翻译和/或蛋白折叠研究
    • 体外区域化

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    • 小鼠 RNase 抑制剂

  • 注意事项

    1. 提供 125 ng/µl 的对照（DHFR）模板。使用 2 µl 模板进行阳性对照反应。在标准的 25 μl 反应体系中核糖体的量为 60 pmoles。提供的对照核糖体足够两次反应的用量。注意事项：可以使用较小剂量的核糖体，但蛋白产量可能会降低。如需更详细的产品使用信息，请参阅产品说明书。
    2. PURExpress 对照模板序列文件：Fasta、GenBank
    3. 贮存条件：试剂盒所有组份必须贮存于 -80℃。

  • 参考文献

    1. Gupta, P., K. Kannan, et al. (2013). Regulation of Gene Expression by Macrolide-Induced Ribosomal Frameshifting. Mol Cell. 52(5), 629-42. PubMedID: 24239289
    2. Tsai, A., J. Chen, et al. (2013). Observing Prokaryotic Translation Elongation in Real-Time using Single-Molecule Fluorescence. Biophysical Journal. 104(2, Supplement 1), 257a.
    3. Vazquez-Laslop, N., H. Ramu, et al. (2010). The key function of a conserved and modified rRNA residue in the ribosomal response to the nascent peptide. EMBO J. 29(18), 3108-3117. PubMedID: 20676057
    4. Vázquez-Laslop, N., H. Ramu, et al. (2011). Nascent peptide-mediated ribosome stalling promoted by antibiotics. Ribosomes. 377-392.
    5. Gupta, P., S. Sothiselvam, et al. (2013). Deregulation of translation due to post-transcriptional modification of rRNA explains why erm genes are inducible. Nat Commun . 4, 1984. PubMedID: 23749080
    6. Harvey, C. J., J. D. Puglisi, et al. (2012). Precursor directed biosynthesis of an orthogonally functional erythromycin analogue: selectivity in the ribosome macrolide binding pocket. J Am Chem Soc. 134(29), 12259-65. PubMedID: 22741553
    7. Kaiser, C. M., D. H. Goldman, et al. (2011). The ribosome modulates nascent protein folding. Science. 334(6063), 1723-7. PubMedID: 22194581
    8. Kannan, K., N. Vázquez-Laslop, et al. (2012). Selective Protein Synthesis by Ribosomes with a Drug-Obstructed Exit Tunnel. Cell. 151(3), 508-520. PubMedID: 23101624
    9. Kopaskie, K. S., K. G. Ligtenberg, et al. (2013). Translational regulation of Yersinia enterocolitica mRNA encoding a type III secretion substrate. Journal of Biological Chemistry. 288(49), 35478-88. PubMedID: 24158443
    10. Martínez, A. K., E. Gordon, et al. (2013). Interactions of the TnaC nascent peptide with rRNA in the exit tunnel enable the ribosome to respond to free tryptophan. Nucleic Acids Research. 42(2), 1245-56. PubMedID: 24137004
    11. Orelle, C., S. Carlson, et al. (2013). Tools for Characterizing Bacterial Protein Synthesis Inhibitors. Antimicrob Agents Chemother. 57(12), 5994-6004. PubMedID: 24041905
    12. Shi, W., X. Zhang, et al. (2011). Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis. Science. 333(6049), 1630-1632. PubMedID: 21835980

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protein Synthesis Reaction using PURExpress (E3313)
    2. Analysis of Synthesized Protein using PURExpress (E3313)
    3. Determination of Protein Synthesis Yield with PURExpress (E3313, E6800, E6840, E6850)
    4. Purification of Synthesized Protein using Reverse His-tag Purification
    5. Measurement of 35S-Methionine Incorporation by TCA Precipitation and Yield Determination using PURExpress

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6800_E3313_E6840_E6850

  • 应用实例

    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where can I find many more detailed FAQs for PURExpress?
    2. How is the Δ Ribosome Kit E3313S different from the PURExpress E6800S kit?
    3. When using PURExpress, I was able to synthesize the target protein, but full-length product is not major species?
    4. When using PURExpress, I was unable to synthesize the control protein?
    5. When using PURExpress, I was able to synthesize the control protein, but the target sample is not present or present in low yield?
    6. Where can find all IMPACT FAQs?
    7. Are there PURExpress citations?

  • 实验技巧

    在冰上融化试剂和建立反应体系
    使用前，请将溶液 A 和 B 充分混合。不要涡旋溶液 B 或核糖体，将其轻轻混合。
    溶液 A 可能呈浑浊白色。以均匀悬浮状态加入到反应中。
    在冰上按下列加样顺序建立反应体系：溶液 A、溶液 B、RNAse 抑制剂、水、模板 DNA 或 RNA
    建立反应体系后，要确保所有试剂都充分混合，可以轻柔地上下吸打混匀并进行短暂瞬时离心，37℃条件下温育 2 到 4 小时。