Tth Argonaute 蛋白（TtAgo） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

TtAgo 原核 Argonaute 蛋白来源于革兰氏阴性嗜热栖热菌（Thermus thermophilus），在 5´ 磷酸化单链 DNA（长度为 16 – 18 nt）的引导下，具有 DNA 介导的核酸内切酶功能。在二价金属离子 Mg2+（或 Mn2+）存在时，TtAgo 的类 RNase H 活性位点才能发生反应（请见产品使用说明 #1），切割底物为向导 ssDNA 的互补序列，切割位点对应向导 ssDNA 上第 10 和 11 个碱基之间的位置。

 

TtAgo 的作用机制

Tth Argonaute 蛋白（TtAgo） |

 

TtAgo 在 65–85℃ 时具有活性（请见产品使用说明 #2），对单链 DNA（ssDNA）活性最高，其次是双链 DNA（dsDNA），对单链 RNA（ssRNA）底物活性最低。TtAgo 与单链向导 DNA 协同作用时，不会切割双链 DNA（dsDNA）底物，只是在与向导 DNA 的互补链上产生切刻。该酶对双链 RNA（dsRNA）底物无活性。切割后的 5ʹ 和 3ʹ 末端产物可进行下游连接（1）。研究表明，在某些情况下，加入热稳定单链 DNA 结合蛋白（ET SSB，NEB #M2401）和/或热稳定解旋酶，有助于切割 dsDNA 底物。

在无向导 DNA 的情况下，TtAgo 会通过一种“剪切”的方式来降解双链 DNA（dsDNA），这被认为是 TtAgo 利用入侵或外源 DNA 自发产生了向导 DNA 的机制（2）。为了防止这种非特异性活性的产生，向导 DNA 的摩尔量需超过 TtAgo 量的 5 倍。此外，向导链要与 TtAgo 一起在大约 75℃ 条件下孵育 10-30 分钟，先形成核蛋白复合物后再加入底物进行反应。如需了解更多详细信息，请参阅“操作说明、说明书 & 用法”部分。

TtAgo 适用于体外应用。

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产品来源

嗜热栖热菌 Argonaute 蛋白（TtAgo）纯化自携带有克隆革兰氏阴性嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）基因的大肠杆菌菌株，其 N 末端融合表达 6X His 标签。

产品类别:
Argonautes Products,
Programmable Nucleases Products

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0665S     -20    
        Tth Argonaute (TtAgo) M0665SVIAL -20 1 x 50 pmol 1 µM
        ThermoPol® Reaction Buffer B9004SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X

  • 特性和用法

    稀释兼容性

    • 稀释液 B

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    300 mM NaCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    否

  • 相关产品

    相关产品

    • T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）
    • ThermoPol® 反应缓冲液套装
    • Nuclease-free Water
    • 超热稳定单链结合蛋白（ET SSB）

  • 注意事项

    1. 1X ThermoPol® 反应缓冲液中 Mg2+ 以 2 mM MgSO4 的形式存在，可适用于大多数应用。Mn2+ 也可以被 TtAgo 利用，但是应该以低约 10 倍的浓度下使用，因为高浓度的 Mn2+ 会抑制 TtAgo 的活性，并且会导致高温条件下非特异性底物降解，尤其是对 RNA 底物。如需了解更多信息，请参阅常见问题和 Tth Argonaute 蛋白（TtAgo）反应优化指南。
    2. TtAgo 蛋白在 65–85+℃ 范围内具有活性。常规反应条件为 75– 80℃ 之间。如果温度低于 70℃，活性会急剧下降。如需了解更多详细信息，请参阅技术文献指南。
    3. 具有 5´ 磷酸末端的向导 ssDNA 长度为 16–18 个核苷酸，可在合成后使用NEB T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）进行磷酸化。
    4. 向导寡核苷酸的摩尔量应超过以 TtAgo 量的 5 倍。
    5. 稀释液 B 可用于稀释 TtAgo。稀释后溶液应储存于 -20℃。

  • 参考文献

    1. Hunt, E. A., Evans Jr, T. C., & Tanner, N. A. (2018). Single-stranded binding proteins and helicase enhance the activity of prokaryotic argonautes in vitro. PloS One. 13 (8), e0203073.
    2. Swarts, D., Szczepaniak, M., Sheng, G., Chandradoss, S., Zhu, Y., & Timmers, E. et al. (2017). Autonomous Generation and Loading of DNA Guides by Bacterial Argonaute. Molecular Cell.. 65 (6), 985-99.
    3. Wang, Y., Sheng, G., Juranek, S., Tuschl, T., & Patel, D. (2008). Structure of the guide-strand-containing argonaute silencing comple. Nature. 456(7219), 209-213.
    4. Swarts, D., Jore, M., Westra, E., Zhu, Y., Janssen, J., & Snijders, A. et al. (2014). DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature. 507(7491), 258-261.
    5. Sheng, G., Zhao, H., Wang, J., Rao, Y., Tian, W., & Swarts, D. et al. (2013). Structure-based cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage. Proceedings Of The National Academy Of Sciences. 111(2), 652-657.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for generating break in phosphodiester backbone with Tth Argonaute (TtAgo, NEB #M0665)
    2. Protocol for creating 5′-Phosphorylated Guides from Unmodified Oligonucleotides for use with TtAgo (NEB #M0665)
    3. High-throughput protocol for phosphorylation of guide oligonucleotides in 96-well PCR plate format (NEB #M0665)

  • 使用指南

  • 应用实例

    • GUIDElines for optimization of Tth Argonaute (TtAgo) reactions

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Can I prepare functional guides for TtAgo from unmodified synthetic oligosCan I prepare functional guides for TtAgo from unmodified synthetic oligos?
    2. Some guides do not seem to be working as well as others with TtAgo. What can be done?
    3. How can I reduce non-specific endonuclease activity with TtAgo?
    4. Can I store TtAgo with a guide “loaded?”
    5. Is TtAgo active in other NEB buffers?
    6. Is TtAgo active at other temperatures?
    7. How much Mg2+ [magnesium(II)] should be included in a typical reaction?
    8. What if I want to use TtAgo with Mn2+ [manganese(II)] instead of Mg2+ [magnesium(II)] as provided in ThermoPol® Reaction Buffer?