Gibson 组装® 克隆试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Gibson 组装® 克隆试剂盒 |   
Gibson 组装法由 J.Craig Venter 研究所的 Daniel Gibson 博士及其同事发明，由 Synthetic Genomics 公司授权予 NEB 许可。不管片段的长短和末端匹配性如何，该方法都可以无缝组装多个 DNA 片段。对于较大的 DNA 构建体而言，该方法易用、灵活、适用性强，因此已被合成生物学领域广泛采用。

Gibson 组装可在等温条件下，单管反应实现多个带重叠末端的 DNA 片段的组装（1,2）。Gibson 组装预混液在同一反应缓冲液中有三种不同的酶活性：

  • 核酸外切酶活性会产生单链 3´ 突出末端，促使互补的末端重复序列（重叠区）退火。
  • DNA 聚合酶活性会填补退火片段的缺口。
  • DNA 连接酶活性能在组装后的 DNA 切刻处进行连接。

最终形成双链闭合的 DNA 分子，可作为 PCR、RCA 的模板或其它分子生物学应用，包括直接转化。Gibson 的团队和其它研究者已成功使用该方法组装寡核苷酸、具有多个重叠的 DNA（15–80 bp）以及数十万个碱基长的片段（1–2）。

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

如需帮助设计引物，请观看引物设计视频。

Gibson 组装克隆方法概述

Gibson 组装® 克隆试剂盒 |


规格：

10 μl 2X Gibson 组装预混液和 6 个片段（5 个片段为 400 bp，1 个片段为 2,780 bp，重叠为 40 bp，每个 0.05 pmol），在 20  l 反应体系中，50℃ 下温育 60 分钟。根据第 12 页的转化操作流程，取 2 μl 预混液/片段混合物转化 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（NEB #C2987）。在含 IPTG/Xgal 的氨苄青霉素抗性平板上涂布 1/10 的复苏菌液并温育过夜，能观测到 100 个以上白色菌落。

Gibson 组装克隆试剂盒操作流程概览：

  • 设计引物以扩增具有适当重叠的片段（和/或载体）
  • 使用超保真 DNA 聚合酶 PCR 扩增片段。
  • 使用超保真 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增或利用限制性内切酶消化来制备线性化的载体。
  • 用琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop™ 仪器或其它方法来测定片段和线性化载体的浓度。
  • 将片段和线性化的载体添加到 Gibson 组装预混液中，并在 50℃ 温育 15 分钟至 1 小时（时长视组装的片段数量而定）。
  • 转化到 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（随试剂盒提供）或直接在其它应用中使用。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
Gibson Assembly®

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E5510S     Multi-temperature    
        NEBuilder® Positive Control N2611AVIAL -20 1 x 0.05 ml Not Applicable
        NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) C2987HVIAL -80 10 x 0.05 ml Not Applicable
        pUC19 Vector N3041AVIAL -20 1 x 0.025 ml 50 pg/µl
        SOC Outgrowth Medium B9020SVIAL 4 1 x 25 ml Not Applicable
        Gibson Assembly Master Mix M5510AVIAL -20 1 x 0.1 ml 2 X

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    DNA 聚合酶（用于制备 PCR 产物）：
    建议使用 Q5 超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0491）或相关产品，例如 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0493）或 Q5 热启动超保真 2X 预混液（NEB #M0494）。
    添加了适合的抗生素的 LB（Luria-Bertani）平板。

  • 优势和特性

    Features

    • 仅需两个小时即可完成组装和转化
    • 灵活的序列设计（无缝克隆）
    • 无需 PCR 纯化步骤
    • 对长达 20 kb 的插入片段仍有较高的转化效率
    • 适用性强，适用于各种 DNA 改造，包括定点突变
    • 含感受态细胞

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    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • SOC Outgrowth 培养基
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    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 强烈建议使用我们的在线工具 NEBuilder™ 来设计 PCR 引物，使其在相邻 DNA 片段之间具有重叠序列，以将其组装到克隆载体。
    2. 贮存说明：
      试剂盒为干冰运输。到货后，请将试剂盒贮存于 -80℃。第一次使用后，请将试剂盒组份贮存于指示温度下。
    3. 使用说明：

      为确保成功组装以及后续成功转化组装的 DNA，NEB 建议遵循以下做法：
      • DNA：如果 Gibson 组装反应液中所有 PCR 产物的总体积不超过 Gibson 组装反应体积的 20%，无需进行 PCR 产物纯化。PCR 产物体积过多会引入更多 PCR 产物中存在的 PCR 反应缓冲液和未使用的引物，从而降低 Gibson 组装和转化的效率。PCR 产物柱纯化可能会使 Gibson 组装和转化的效率增加 2–10 倍，在组装三个或更多 PCR 片段时，或组装长度超过 5 kb 的片段时，强烈建议进行 PCR 产物柱纯化。用于组装的纯化 DNA 可溶于 ddH2O（推荐使用 Milli-Q® 水或同等纯度的水）、TE 或其它稀释缓冲液。
      • 插入片段：直接将片段组装到克隆载体中时，组装片段的浓度应比载体浓度高至少 2–3 倍。将多个片段组装到载体时，建议使用等摩尔比的片段。
      • 转化：推荐使用随试剂盒提供的 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C2987）来转化组装小于 20 kb 的片段。也可使用除 BL21、BL21(DE3)、Lemo21(DE3) 和 Nico21(DE3) 外的其它 NEB E. coli 感受态细胞。例如，Shuffle T7 Express E. coli 感受态细胞可用于表达困难蛋白。使用 NEB 以外的供应商的 E. coli 感受态细胞时，Gibson 组装反应液转化的稳定性会降低。
      • 电转化：电转化可以将转化效率提高几个数量级。将 Gibson 组装预混液产品用于电转化时，需要将反应液稀释 3 倍，并取 1 μl 用于转化。如果需要使用电转感受态细胞，请遵守“电转感受态细胞转化操作流程”。

  • 参考文献

    1. Gibson, D.G. et.al. (2009). Nature Methods. 343-345.
    2. Gibson, D.G. et al. (2010). Nature Methods. 901-903.
    3. Barnes, W.M. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci.. 91, 2216-220.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Gibson Assembly® Protocol (E5510)
    2. Gibson Assembly® Chemical Transformation Protocol (E5510)
    3. Gibson Assembly® Electrocompetent Cells Transformation Protocol (E5510)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE2611_E5510

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBuilder® Assembly Tool

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. I am not sure whether to choose NEBuilder HiFi DNA Assembly or NEB Gibson Assembly? How are the products different?
    2. What are the advantages of this method compared to traditional cloning methods?
    3. How large of a DNA fragment can I assemble?
    4. How many fragments of DNA can be assembled in one reaction?
    5. What are the shortest overlaps that can be used with this assembly method?
    6. What are the longest overlaps that can be used with this method?
    7. Can ≤ 200 bp dsDNA fragments be assembled by this method?
    8. Can ssDNA oligonucleotides be combined and assembled with dsDNA fragments?
    9. Will the reaction work at other temperatures?
    10. Is it necessary to purify PCR products when doing DNA assemblies using either NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix or Gibson Assembly Master Mix?
    11. Is it necessary to inactivate restriction enzymes after vector digestion?
    12. I would like to produce overlapping dsDNA fragments by PCR. Do I need to use PCR primers that have been purified by PAGE or HPLC?
    13. Can I use a 15-nt overlap that is entirely composed of His-tag repeats (i.e., CACCACCACCACCAC)?
    14. I would like to assemble ssDNA oligonucleotides into dsDNA fragments. Do I need to use oligonucleotides that have been purified by PAGE or HPLC?
    15. Can I PCR-amplify the assembled product?
    16. What should I do if my assembly reaction yields no colonies, a small number of colonies, or clones with the incorrect insert size following transformation into E. coli?
    17. How can I reduce the number of vector-only background colonies?
    18. What type of competent cells are suitable for transformation of DNA constructs created using Gibson Assembly?
    19. Can I use electroporation instead of chemical transformation?
    20. Are there any differences between the Gibson Assembly Master Mix (NEB #E2611) and Gibson Assembly Master Mix included in the Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510)?
    21. Are there any differences between the requirements for 2-3 fragmentassemblies versus 4–6?
    22. The Gibson Assembly Master Mix control reaction is not giving me any colonies. Why?
    23. When using a polymerase that doesn’t contain a 3′-5′ exonuclease activity (such as Taq DNA Polymerase) to amplify fragments to be used in a Gibson Assembly reaction, should I be concerned about the potential 3′ mismatch generated by the addition of a non-templated nucleotide?
    24. When my Gibson Assembly Cloning Kit arrived, it was stored at -80°C. Will this harm the Gibson Assembly Master Mix?
    25. I would like to use NEBuilder but am concerned about user data privacy. How does NEB handle the information that I enter into NEBuilder?
    26. Can I Use other primer design tools such as SnapGene for Gibson Assembly, to design primers for NEBuilder HiFi DNA Assembly?
    27. What antibiotic resistance is encoded in the NEBuilder Positive Control (assembly control)?