SplintR® 连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

SplintR 连接酶，也称为 PBCV-1 DNA 连接酶或小球藻（Chlorella）病毒 DNA 连接酶，可有效催化以互补 RNA 链为夹板的相邻单链 DNA 的连接。这种以前未报告的活性或许能为 miRNA 和 mRNA（包括 SNP）表征提供新方法。SplintR 非常适合用于许多二代测序和分子诊断等应用中的靶标富集流程。此酶具有稳健的活性，并对以 RNA 为夹板的 DNA 底物（表观 Km = 1 nM）表现出亲和力，能够对复杂混合物中独特的 RNA 种类进行亚纳摩尔级检测，使 SplintR 连接酶成为要求苛刻的 RNA 检测技术的理想选择。

此酶在宽泛的 ATP 浓度（10 µM – 1 mM）和 pH（6.5 – 9）范围内都具有活性。在 Mg2+ > 5 mM，pH 值位于 7.5 至 8.0 的条件下，可观察到最佳活性。较高温度（高达 37℃）和补充 5 mM Mn2+ 可以增强该酶活性。盐浓度超过 100 mM 会抑制反应。

该酶可以兼容连接结合处的所有碱基对组合，但其活性受供体（磷酸化）侧连接结合处 dC/G 和 dG/C 碱基对的部分抑制，尤其是 +2 碱基也是 C/G 碱基对时。

连接由 RNA 充当夹板的 DNASplintR® 连接酶 |
（A）连接分析概述：5´-磷酸化、3´-FAM 标记的 DNA“供体”寡核苷酸和未经修饰的 DNA“受体”寡核苷酸退火到互补的 RNA 夹板上。此底物与连接酶反应得到由未反应的起始材料（I）、腺苷酸化的 DNA（II）和连接产物（III）组成的混合物。这些产物经过变性，通过毛细管电泳分离并使用荧光进行检测。在 SplintR 连接酶反应缓冲液中，25℃，15 分钟条件下用（a）无酶、（b）1 μM T4 DNA 连接酶和（c）100 nM SplintR 连接酶，对以 RNA 为夹板的底物进行连接。图中标注的峰分别为起始 pDNA（I）、AppDNA（II）和连接产物（III），该结果通过与合成制备的标准品共洗脱确定。（C）分析由 SplintR 连接酶或 T4 DNA 连接酶催化的连接产物比例。通过分别将两种连接酶浓度设定在 10 pM 至 10 μM 范围内，在 25℃，15 分钟条件下进行多组连接反应，相较于 T4 DNA 连接酶，SplintR 连接酶对以 RNA 为夹板的 DNA 的连接效率明显更高。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有编码 PBCV-1 DNA 连接酶的重组基因。

产品类别:
RNA Ligation,
DNA Ligases Products

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0375S     -20    
        SplintR® Ligase M0375SVIAL -20 1 x 0.05 ml 25,000 units/ml
        SplintR Ligase Reaction Buffer B0375SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
    • M0375L     -20    
        SplintR® Ligase M0375LVIAL -20 1 x 0.25 ml 25,000 units/ml
        SplintR Ligase Reaction Buffer B0375SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位是指在 20 μl 反应体系中，使用 1X SplintR 连接酶反应缓冲液，在 25℃ 条件下，15 分钟连接（完成 50%）2 pmol 三重 FAM 标记的 DNA:RNA 杂交底物所需的酶量。

    1X SplintR 连接酶反应缓冲液
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM ATP
    10 mM DTT
    pH 7.5，25℃ 时

    反应条件

    1X SplintR Ligase Reaction Buffer
    Incubate at 25°C

    1X SplintR Ligase Reaction Buffer
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM ATP
    10 mM DTT
    (pH 7.5 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    300 mM NaCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 20 minutes

  • 优势和特性

    Features

    • 基于锁式探针的 microRNA 检测

    应用特性

    • 催化以互补 RNA 序列为夹板的 ssDNA 的连接
    • 通过 DNA 探针的连接检测 RNA
    • 检测 SNP 或剪接变体
    • RASL-seq

  • 注意事项

    1. 一价阳离子会抑制 SplintR 连接酶的活性。强烈建议确保这些常见反应物（NaCl、KCl）在反应中的浓度保持在 50 mM 以下。酶在提供时保存在含 300 mM NaCl 的储存缓冲液中，以确保储存的稳定性。建议添加到反应中之后，酶至少稀释 6 倍，最佳稀释度不小于 10 倍。
    2. 如需稀释酶用于储存，推荐使用稀释液 A（NEB #B8001）。
    3. SplintR 反应应当在 16 – 37℃ 之间进行。我们建议初始测试在 25℃ 条件下进行。
    4. 该酶以 10.5 μM 溶液的形式提供。我们建议在反应体系中将酶量保持在 1 μM 以下，推荐的酶量范围为 100 nM 至 1 μM。对许多应用而言，理想起始酶量为超过可连接末端的 2 倍。例如，在附图呈现的实验中，最佳底物浓度为 100 nM。在该流程中，250 nM 酶可在 15 分钟内实现对所有测试序列的完全连接。
    5. 如果反应没有按预期有效进行，我们强烈建议延长温育时间，而不是将反应中的酶浓度增加到 1 μM 以上。
    6. 对于顽固性底物，可选择使用低浓度 ATP。对于标准 SplintR 连接酶反应缓冲液中连接效率较低的底物（例如在连接结合处具有 G:C 碱基对的底物），低 ATP 缓冲液可以得到更高产量的连接产物。我们建议使用 1X T4 RNA 连接酶反应缓冲液（NEB #B0216），并添加 ATP（NEB #P0756）使其终浓度为 10 μM。
    7. 建议 RNA 夹板至少包含 20 个互补碱基。我们发现，结合处任意一侧存在 10 bp dsDNA/RNA 足以满足所有测试底物的需求。夹板不一定需要以连接结合处为中心，然而，当连接点一侧少至 4 个碱基时，对于含有 20 个碱基完全互补区的夹板，实现完全连接取决于底物序列。如果需要重叠区 <10 bp，则需要进行一些测试来确定特定序列双链区域的最小长度。
    8. 为了最大限度提高 SplintR DNA 连接酶的连接保真度，请注意以下事项：
      • 提高反应温度可以增加 SplintR DNA 连接酶的活性和特异性。在 37℃ 条件下进行温育可以改善检测 microRNA [2] 的结果。
      • 经证明，在使用 SplintR DNA 连接酶 [3] 将 DNA 探针连接到 RNA 时，添加超热稳定单链结合蛋白（ET SSB）（NEB #M2401）也可以增加活性并减少脱靶连接。

  • 参考文献

    1. Lohman, G. et al. (2014). Nucl. Acids Res. 42, 1831-1844. DOI: 10.1093/nar/gkt1032.
    2. Jingmin, J. et al. (2016). Nucl. Acids Res. 44, e116. DOI: 10.1093/nar/gkw399.
    3. Eugene, J., Wee, H. and Trau, M. (2016). ACS Sens. 1, 670-675.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Ligation protocol using SplintR® Ligase (NEB #M0375)

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Properties of DNA and RNA Ligases
    • Substrate-based Ligase Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What type of ends does SplintR Ligase join?
    2. I would like to use SplintR Ligase in a workflow, but not use the provided reaction buffer. Can you tell me what reaction buffer components are needed?
    3. Can you tell me what inhibits SplintR Ligase?
    4. SplintR Ligase seems very concentrated at 25 units per microliter. How do I know how much to add to my reaction?
    5. How can I maximize ligation fidelity when using SplintR DNA Ligase?
    6. Can SplintR® DNA Ligase be used for ligation-based methods of microRNA detection?