热敏磷酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

热敏磷酸酶（AnP）是不耐热的碱性磷酸酶，重组表达后纯化得到。AnP 可非特异性催化 DNA 和 RNA 的 5´ 和 3´ 末端磷酸单酯的去磷酸化。另外，AnP 还水解核糖核苷酸和脱氧核糖核苷三磷酸（NTP 和 dNTP）。AnP 在许多分子生物学应用中有着重要作用，例如去除 DNA 和 RNA 的磷酸化末端用于后续的克隆或探针末端标记。在克隆中，对线性化质粒 DNA 去磷酸化，可防止自连。该酶作用于 5´ 突出端、5´ 凹陷端和平末端。AnP 也可以用来降解 PCR 反应中的游离 dNTP，用于制备 DNA 测序或 SNP 分析模板。AnP 在 80℃ 下加热 2 分钟即可完全且不可逆地失活，因此无需在连接或末端标记前去除 AnP。

产品来源

大肠杆菌菌株，其携带的 TAB5 AP 基因最初在质粒 pNI（2）中克隆，然后在质粒 pEGTAB7-4.1（3）中重新克隆。

产品类别:
Phosphatases Products,
RNA Modification

应用:
Dephosphorylation

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0289V     -20    
        Antarctic Phosphatase M0289VVIAL -20 1 x 0.1 ml 5,000 units/ml
        Antarctic Phosphatase Reaction Buffer B0289SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X
    • M0289S     -20    
        Antarctic Phosphatase M0289SVIAL -20 1 x 0.2 ml 5,000 units/ml
        Antarctic Phosphatase Reaction Buffer B0289SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X
    • M0289L     -20    
        Antarctic Phosphatase M0289LVIAL -20 1 x 1 ml 5,000 units/ml
        Antarctic Phosphatase Reaction Buffer B0289SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位指在 37℃ 条件下，30 分钟对经限制性内切酶消化产生 5´ 凹陷末端的 1 µg pUC19 载体 DNA 进行去磷酸化所需的酶量。去磷酸化标准是指在自连反应中能抑制 > 95% 的 DNA 重新环化，且通过转化大肠杆菌细胞进行检测。

    反应条件

    1X 热敏磷酸酶反应缓冲液
    Incubate at 37°C

    1X 热敏磷酸酶反应缓冲液
    50 mM Bis-Tris-Propane-HCl
    1 mM MgCl2
    0.1 mM ZnCl2
    (pH 6 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    1 mM MgCl2
    50% Glycerol
    0.01 mM ZnCl2
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    80°C for 2 minutes

    分子量

    实际: 35 kDa
    理论上的: 69 kDa

    单位活性检测条件

    在添加了热敏磷酸酶反应缓冲液的限制性内切酶缓冲液中对载体 DNA 进行去磷酸化。使用 NEB 快速连接试剂盒（NEB #M2200）对 50 ng 载体进行连接。

  • 优势和特性

    应用特性

    • DNA 和 RNA 的 5´ 与 3´ 末端的去磷酸化。
    • 克隆载体 DNA 去磷酸化，防止载体自连。
    • 在使用 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）标记末端前对 DNA 进行去磷酸化。
    • 在测序或 SNP 分析前处理 PCR 反应中的 dNTP。

  • 相关产品

    相关产品

    • T4 DNA Ligase
    • 快速连接™试剂盒
    • 瞬时粘性末端连接酶预混液
    • 平末端/TA 连接酶预混液
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）
    • 热敏磷酸酶反应缓冲液

  • 注意事项

    1. 添加 1/10 体积的 10X 热敏磷酸酶反应缓冲液，将提供酶发挥活性所需的 Zn2+ 量。
    2. 热敏磷酸酶在所有限制性内切酶 NEBuffer 1.1、2.1、3.1 和 CutSmart® 缓冲液（10X）中也具有活性，但需要添加 1/10 体积的 10X 热敏磷酸酶反应缓冲液。
    3. 添加一价盐后可提高热敏磷酸酶的活性。
    4. 金属螯合剂（如 EDTA）、无机磷酸盐和磷酸盐类似物会抑制热敏磷酸酶的活性。添加还原剂（DTT、β-ME）后，热敏磷酸酶的活性降低。
    5. 分子量：热敏磷酸酶是同源二聚体。单体分子量为 35 kDa。
    6. 与大多数碱性磷酸酶一样，热敏磷酸酶是一种 Zn2+ 和 Mg2+ 依赖型酶，反应需要补充锌离子。

  • 参考文献

    1. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
      . (2nd ed.), 5.72.
    2. Rina, M. et al. (2000). Eur. J. Biochem.. 267, 1230-1238.
    3. Guthrie, E., unpublished results. Unpublished observation

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Dephosphorylation of 5´-ends of DNA using Antarctic Phosphatase (NEB #M0289)

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

工具 & 资源

  • 选择指南

    • NEB Diluent and Buffer Table
    • Phosphatase Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBcloner®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Which alkaline phosphatase, Quick CIP, rSAP or Antarctic Phosphatase works best?
    2. The number of colonies that don’t contain an insert seems high, how can I tell if the Antarctic Phosphatase worked?
    3. Will Quick CIP, rSAP or Antarctic Phosphatase (AnP) dephosphorylate proteins?
    4. Does the DNA need to be purified after the restriction digest, prior to Antarctic Phosphatase treatment?
    5. Does the DNA need to be purified after Antarctic Phosphatase treatment?
    6. What is the molecular weight?
    7. Can Antarctic Phosphatase be heat inactivated?
    8. What phosphate groups are removed by rSAP, Quick CIP, or Antarctic Phosphatase (AnP)?
    9. Does the DNA need to be purified after a restriction digest and prior to the dephosphorylation step?
    10. Does the DNA need to be purified after the dephosphorylation step and prior to the ligation step?
    11. Are the alkaline phosphatases active in NEBuffers?
    12. Cloning Problem: Too much background in the transformation step.