产品信息

• 产品组分信息

  本产品提供以下试剂或组分：

  NEB #	名称	组分货号	储存温度	数量	浓度
  M0317S     -20       T3 DNA Ligase M0317SVIAL -20 1 x 0.034 ml 3,000,000 units/ml   StickTogether™ DNA Ligase Buffer B0535AVIAL -20 1 x 1 ml 2 X
  M0317L     -20       T3 DNA Ligase M0317LVIAL -20 1 x 0.25 ml 3,000,000 units/ml   StickTogether™ DNA Ligase Buffer B0535AVIAL -20 3 x 1 ml 2 X

• 特性和用法

  单位定义

  1 单位是指在 20 μl 反应体系中，1X T3 DNA 连接酶反应缓冲液条件下，25℃ 温浴 1 分钟，能使 50% 的 100 ng λ 经 HindIII 消化的 DNA 连接所需的酶量。

  反应条件

  1X StickTogether™ DNA 连接酶缓冲液
  Incubate at 25°C

  1X StickTogether™ DNA 连接酶缓冲液
  66 mM Tris-HCl
  10 mM MgCl₂
  1 mM ATP
  1 mM DTT
  7.5% Polyethylene glycol (PEG 6000)
  (pH 7.6 @ 25°C)

  贮存溶液

  10 mM Tris-HCl
  50 mM KCl
  1 mM DTT
  50% Glycerol
  0.1 mM EDTA
  pH 7.4 @ 25°C

  热失活

  否

• 优势和特性

  应用特性

  • 克隆限制性内切酶消化生成的 DNA 片段
  • 克隆 PCR 产物
  • 将连接子或接头与双链 DNA 相连
  • 线性 DNA 环化
  • 双链 DNA 切刻位点连接
  • 定点突变

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• 注意事项

  1. ATP 是反应中必不可少的辅因子。这与需要 NAD 作为辅因子的 E. coli DNA 连接酶不同。

     T3 DNA 连接酶在不含 PEG 6000 的缓冲液中同样具有活性，例如我们的 T4 DNA 连接酶缓冲液和 NEBuffer 1 – 4，适用于不宜使用 PEG 6000 的应用。务必在反应体系中添加终浓度为 1 mM 的 ATP。在这些缓冲液中，T3 DNA 连接酶的活性约为 1/10。在需要维持高浓度 NaCl 的实验中，我们建议使用不含 PEG 6000 的反应缓冲液。

  2. T3 DNA Ligase is also active in buffers without PEG 6000, such as our T4 DNA Ligase Buffer and NEBuffers, for applications in which PEG 6000 is detrimental. Please remember to supplement the reaction with 1 mM ATP (final concentration). In these buffers T3 DNA Ligase exhibits an approximately 10-fold reduction in activity. In applications where a high concentration of NaCl needs to be maintained, we suggest using a reaction buffer without PEG 6000.
  3. 在 10–20 μl 反应体系中标准载体 + 插入片段的连接，通常是 25℃ 条件下反应 30 分钟。
  4. 如果稀释酶需要在 -20℃ 条件下长期储存，应使用含有 50% 甘油的贮存缓冲液稀释。该酶可以使用稀释液 A（NEB #B8001）稀释，其中含有的 BSA 不会产生影响。
  5. 65℃ 加热反应液 10 分钟，可使其中的 T3 DNA 连接酶失活。不过，反应需要在不含 PEG 的缓冲液中进行。如果反应缓冲液中含有 PEG，则不能进行热失活反应，因为转化会受到抑制。

• 参考文献

  1. Cai, L. et al. (2004). J. Biochem. 135, 397-403.
  2. Bauer RJ, Zhelkovsky A, Bilotti K, Crowell LE, Evans TC Jr, McReynolds LA, et al. (2017). Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS ONE. 12(12): e0190062., DOI: 0190062,

操作说明、说明书 & 用法

• 操作说明

  1. Ligation Protocol with T3 DNA Ligase (M0317)

• 使用指南

  • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer
  • Tips for Maximizing Ligation Efficiencies

工具 & 资源

• 选择指南

  • DNA Ligase Selection Chart
  • Properties of DNA and RNA Ligases
  • Substrate-based Ligase Selection Chart

• Web 工具

  • NEBcloner^®
  • NEBioCalculator®

FAQs & 问题解决指南

• FAQs

  1. What type of DNA ends can T3 DNA Ligase ligate?
  2. Can T3 DNA Ligase be used with a buffer that does not contain PEG?
  3. Does T3 DNA Ligase have a higher tolerance to salt than T4 DNA Ligase?
  4. Can T3 DNA Ligase be heat inactivated?
  5. What are some potential problems with the ligation reaction using T3 DNA Ligase that can lead to transformation failure?
  6. What are some other problems that should be considered when trouble shooting a transformation problem?
  7. What problems can be encountered in the restriction digest that can cause ligation using T3 DNA Ligase or subsequent transformation to fail?
  8. What controls should be run to test the cells and DNA when using T3 DNA Ligase?
  9. How much DNA should be used in a ligation using T3 DNA Ligase?
  10. Will T3 DNA Ligase work in rCutSmart Buffer?

• 问题解决指南

  • Troubleshooting Tips for Ligation Reactions