瞬时粘性末端连接酶预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

瞬时粘性末端连接酶预混液是一种即用型 2X 预混液，内含 T4 DNA 连接酶、专有连接增强剂和经优化的反应缓冲液。该预混液专为瞬时连接粘性末端（2 – 4 bp）底物和提高转化效率而设计，还简化了建立反应体系所需的步骤，并优化了酶和缓冲液组分的比例。由于该预混液在 -20℃ 条件下储存时为液体状态，使用时无需解冻*，并且无需温育即可高效连接亚克隆粘性末端底物。反应时仅需将预混液添加到互补末端的 DNA 中，混匀后转化，因此可节省常规连接所需的宝贵时间。此外，可在 DNA 浓度低的小体系中进行亚克隆连接，为用户节省了宝贵的 DNA 样品，并且无需稀释，可直接转化到多种化学感受态大肠杆菌菌株中。

* 冰箱的实际内部温度会有所不同。我们的测试表明，该预混液在 -20℃ 条件下储存时为液体状态。在 -70℃ 条件下进行的冻融测试则表明，该预混液反复冻融 20 次后，性能并无明显变化。

产品来源

从大肠杆菌菌株中纯化获得，其携带有编码 T4 DNA 连接酶的重组基因。

产品类别:
DNA Ligases Products

应用:
Cloning Ligation,
Fast Cloning: Accelerate your cloning workflows with reagents from NEB

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0370S     -20    
        Instant Sticky-end Ligase Master Mix M0370SVIAL -20 1 x 0.25 ml 2 X
    • M0370L     -20    
        Instant Sticky-end Ligase Master Mix M0370LVIAL -20 1 x 1.25 ml 2 X

  • 特性和用法

    热失活

    否

  • 优势和特性

    应用特性

    • 载体构建
    • 片段组装
    • 文库构建

  • 相关产品

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    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. DNA：用于连接的纯化 DNA 可溶于 dH2O（推荐使用 Milli-Q® 水或同等纯度的水）；也可使用 TE 或其它稀释缓冲液。为实现最佳连接效果，须添加 20 – 100 ng 的载体 DNA 及 3 倍摩尔量的插入片段。若连接体积大于 10 μl，则相应增加瞬时粘性末端连接酶预混液的体积，使其始终占反应体系的 50%。对于单片段插入，插入片段与载体的最佳比例为 2:1 至 6:1。低于 2:1 就会导致较低的连接效率，高于 6:1 则会导致多片段插入。如果无法确定 DNA 浓度，请以不同的比例进行多个平行的连接。
    2. 时间和温度：使用瞬时粘性末端连接酶预混液进行的连接可直接转化到大肠杆菌中。如果需要在转化前进行温育反应液，4 – 25℃温育通常效果较好。该反应液在选定的温度条件下温育即使长达 1 小时，也不会明显影响性能。平末端和 TA 末端连接也可使用这种预混液，但需要 5 – 15 分钟的温育时间才能达到我们的内部性能标准。长度为 2 – 4 bp 粘性末端的连接符合“瞬时”连接的标准。
    3. 细胞：感受态细胞的效率可能相差几个数量级。观察到的连接效率与用于转化的感受态细胞效率有直接关系。转化未切割载体作为对照，以用于比较。
    4. 电转化：尽管电转化可以显著提高转化效率，但瞬时粘性末端连接酶预混液不适合直接用于转化，需要降低 PEG 浓度。我们建议通过离心柱纯化连接后的 DNA。
    5. 生物学特性：某些 DNA 序列不易克隆。大肠杆菌会倾向于丢失形成结构的 DNA 序列，包括反向重复序列和串联重复的序列。大肠杆菌无法耐受某些重组蛋白，因此可能会导致转化率较差或菌落数较小。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Ligation Protocol for Cloning with Instant Sticky-end Ligase Master Mix (M0370) 
    2. Transformation Protocol (M0370)

  • 使用指南

    • Tips for Maximizing Ligation Efficiencies

  • 应用实例

    • Efficient Adaptor Ligation for the Preparation of dsDNA Libraries using the Blunt/TA Ligase Master Mix

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • Properties of DNA and RNA Ligases
    • Substrate-based Ligase Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBcloner®
    • NEBioCalculator®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Do I need to transform the Instant Sticky-end Ligase Master Mix reactions immediately?
    2. Can the ligation reaction produced by the Instant Sticky-end Ligase Master Mix be directly used to transform electrocompetent cells?
    3. The recommended volume for an Instant Sticky-end Ligase Master Mix reaction is 10ul. I like to set-up my ligation reactions in a 20 ul volume. Can I scale-up the reaction?
    4. I routinely use more than 5 ul of my ligation reactions to transform 50 ul aliquots of competent cells. When I do this with the Instant Sticky-end Ligase Master Mix my transformation plates have very few colonies. What do you think is the problem?
    5. Can the Instant Sticky-end Ligase Master Mix be used for the ligation of blunt-end or single-base overhang fragments?
    6. My Instant Sticky-end Ligase Master Mix has frozen in my freezer. Is this a problem?
    7. The protocol for Instant Sticky-end Ligase Master Mix indicates thereaction should not be heat inactivated. How can I inactivate theligation activity?

  • 问题解决指南

    • Troubleshooting Guide for Cloning
    • Troubleshooting Tips for Ligation Reactions