T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

T4 多聚核苷酸激酶能够催化 ATP 的 γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链（双链或单链 DNA 或 RNA）的 5´-羟基末端以及 3´-单磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶还具有 3´ 磷酸酶活性，将 3´-磷酸基团从寡核苷酸的 3´ 磷酸末端、脱氧 3´-单磷酸核苷和脱氧 3´-二磷酸核苷上水解掉（1）。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）基因。酶纯化参考改进 Richardson 方法进行（1）。

产品类别:
DNA Labeling Products,
Kinases Products

应用:
Phosphorylation (Kinase)

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0201V     -20    
        T4 Polynucleotide Kinase M0201VVIAL -20 1 x 0.025 ml 10,000 units/ml
        T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer B0201SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
    • M0201S     -20    
        T4 Polynucleotide Kinase M0201SVIAL -20 1 x 0.05 ml 10,000 units/ml
        T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer B0201SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
    • M0201L     -20    
        T4 Polynucleotide Kinase M0201LVIAL -20 1 x 0.25 ml 10,000 units/ml
        T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer B0201SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位即 1 Richardson 单位，指在 50 μl 总反应体系，含有 66 µM [γ-32P] ATP（5 x 106 cpm/µmol）和 0.26 mM 5´ 羟基末端鲑鱼精子 DNA 的 1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液中，37℃ 条件下，30 分钟内催化 1 nmol [32P] 掺入酸不溶物所需的酶量（1）。

    反应条件

    1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液
    Incubate at 37°C

    1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液
    70 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    5 mM DTT
    (pH 7.6 @ 25°C)

    使用浓度

    10,000 units/ml

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    50 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    50% Glycerol
    0.1 µM ATP
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 20 minutes

  • 优势和特性

    应用特性

    • DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行 DNA 测序（2）
    • 在寡核苷酸上添加 5´ 磷酸，以便进行后续连接
    • 除去 3´ 磷酸基团（3）

  • 相关产品

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    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

    单独销售的组分

    • T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液

  • 注意事项

    1. 提高 ATP 的浓度可让缺口磷酸化。切刻位点不能有效地磷酸化。CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可以替代 ATP 作为磷酸供体（1）。
    2. 利用交换反应可以避免末端标记前的去磷酸化，尽管这会导致较低的标记比活性。
    3. 在反应体系中添加终浓度为 100 µM ADP 便仍可保持足够的掺入水平。要达到更高的掺入水平，请使用参考文献（2）中所描述的缓冲液。

  • 参考文献

    1. Richardson, CC. (1981). The Enzyme. 14, 299-314.
    2. Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual.. 10.59-10.67,11.31-11.33.
    3. Cameron, V. and Uhlenbeck, O.C. (1977). Biochemistry. 16, 5120-5126.
    4. Berkner, K.L. and Folk, W.R. (1977). J. Biol. Chem.,. 252, 3176-3184.
    5. Soltis, D.A. and Uhlenbeck, 0.C. (1982). J. Biol. Chem.. 257, 11332-11339.
    6. Wang, L.K. and Human, S. (2001). J. Biol. Chem.. 276, 26868-26874.
    7. Wang, L.K. and Shuman, S. (2002). Nucl. Acids Res.. 30, 1073-1080.
    8. Vance, J.R. and Wilson, T.E. (2001). Mol. Cell. Biol. 21, 7191-7198.
    9. Interthal, H. et al. (2005). J. Biol. Chem.,. 280, 36518-36528.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Radioactive Labeling with T4 PNK or T4 PNK (3´ phosphatase minus)
    2. Non-radioactive Phosphorylation with T4 PNK or T4 PNK (3´ phosphatase minus)
    3. End-labeling Protocol

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

工具 & 资源

  • 选择指南

    • NEB Diluent and Buffer Table

  • Web 工具

    • NEBcloner®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What factors can cause incomplete phosphorylation when using T4 Polynucleotide Kinase?
    2. Can I use T4 Polynucleotide Kinase and T4 DNA Ligase in the same reaction buffer?
    3. How can the rate of phosphorylation be improved when using T4 Polynucleotide Kinase?
    4. Do I need to dephosphorylate prior to labeling?
    5. How much substrate can be phosphorylated in a standard reaction?
    6. How many units of T4 Polynucleotide Kinase should be used for a typical reaction?
    7. How do I inactivate the enzyme?
    8. How to calculate the molarity of ends?
    9. What labels can be used?
    10. Will T4 Polynucleotide Kinase work in rCutSmart Buffer?