Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接染料法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒包括：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB＃E3032S）和 2）Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005L）。

细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10 – 100,000 个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解物（相当于 0.2 – 4,000 个细胞的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使整个加样流程可视化。

Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒兼容大多数实时荧光定量仪器的 SYBR®/FAM 荧光通道，可对靶标 RNA 序列执行染料法实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量。

下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 个 10 倍梯度稀释（在 50 µl 体系中裂解 10 – 100,000 个细胞），并取 1 µl 裂解物在 20 µl 体系中进行一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果显示在最后一列。此外，经测试一些昆虫细胞系也能使用上述裂解液裂解。

表 1：经验证过的细胞系
 

细胞系 性质 属 50 μl 体系可裂解的细胞数
A549 粘着型 智人、肺、癌 10 – 100,000
HEK293 粘着型 智人、肾 10 – 100,000
HeLa 粘着型 智人、子宫颈、腺癌 10 – 100,000
HepG2 粘着型 智人、肝脏、癌 10 – 1,000
NCI-H460 粘着型 智人、肺、癌 10 – 100,000
SK-N-SH 粘着型 智人、大脑、成神经细胞瘤 10 – 10,000
U2Os 粘着型 智人、骨骼、骨肉瘤 10 – 100,000
Jurkat 悬垂型 智人、T 淋巴细胞、白血病 10 – 100,000
K-562 悬垂型 智人、成淋巴细胞、白血病 10 – 100,000
图 1：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从培养细胞（50 µl 体系可裂解高达 100,000 个细胞）中进行 RNA 检测和定量的所有必要组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解物（相当于 0.2 – 4,000 个细胞中的 RNA）即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。
图 2：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5 个 10 倍梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量

Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

梯度稀释的 HeLa 细胞（10 – 100,000）使用标准反应条件（37℃ 裂解 10 分钟，25℃ 灭活 5 分钟），在 50 μl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005），将 1 μl 细胞裂解物作为起始量（相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中的 0.2 – 2,000 个细胞）对目的基因（GOI）进行定量，每个起始量浓度都做了重复。结果展示了一个高频靶标（A）：β-actin 和一个低频靶标（B）：SMG1。右图展示了扩增效率（E）和线性关系（R2）。
图 3：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5 个 10 倍梯度稀释的细胞起始量进行精准可信的 RNA 定量

Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

梯度稀释的 A549 细胞（10 – 100,000）使用标准反应条件（37℃ 裂解 10 分钟，25℃ 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB＃E3032）中裂解。也可使用柱提法 RNA 提取试剂盒提纯 RNA。A. 使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3005），将 1 μl 细胞裂解物（实心圆）或纯化的 RNA（空心圆）作为起始量（相当于 20 µl RT-qPCR 反应体系中的 0.2 – 2,000 个细胞）对目的基因（GOI）进行定量，每个起始量浓度都做了重复。左图：在 5 个 10 倍梯度稀释的细胞起始量中检测高频靶标 β-actin 和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率（E）在图中左下方显示。B. 根据（A）中 5 个 10 倍梯度稀释的细胞起始量计算每次稀释时（ΔCq（GOI））相对于 β-actin 的 Cq 值。平均 Cq 通过横线指示。
图 4：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。

Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

梯度稀释的 A549 细胞（10 – 100,000）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB #E3032）中裂解。或者，参照相应厂家产品说明书，使用市售的 Bio-Rad（SingleShot SYBR Green 一步法试剂盒，#172-5095）、Qiagen（FastLane Cell SYBR Green 试剂盒，#216213）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 一步法 PowerSYBR Green 试剂盒，A25600）试剂盒，裂解同样数量的细胞。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，将 1 μl 细胞裂解物作为起始量（相当于 20 µl RT-qPCR 反应体系中 0.2 – 2,000 个细胞），对目的基因进行定量，每个浓度的样品都做了重复。对于所有试剂盒，5 个 10 倍梯度稀释的细胞起始量均显示了高频靶标 β-actin 和低频靶标 RPL32 和 Tubulin 的扩增。为了使结果标准化，将总荧光的 12% 设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低起始量的 Cq 值。
图 5：对 24 个靶标测试显示，Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒与其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒相比，灵敏度最高。

Luna® Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

使用标准反应条件或按照厂商产品说明书使用市售试剂盒，在 50 µl Luna Cell Ready 裂解反应（NEB #E3032）中，对大约 2,500 个 A549 细胞进行裂解。每个试剂盒做两个生物重复。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，将 1 μl 细胞裂解物作为起始量（相当于 20 µl RT-qPCR 反应中 50 个细胞），对 24 个目标基因进行定量，每个生物样品均做重复。结果显示了 NEB（实心橙色圆圈）、BioRad（空心正方形）、Qiagen（空心三角形）和 Thermo Fisher（十字形）的平均 Cq。为了使结果标准化，将总荧光的 12% 设置为阈值。Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒显示了不同表达水平下 23/24 的基因 Cq 值最早，平均比 Bio-Rad 快 2.3 Cq，比 Qiagen 快 3.8 Cq，比 Thermo Fisher Scientific 快 3.6 Cq。
产品类别:
Luna® qPCR & RT-qPCR Products,
PCR, qPCR & Amplification Technologies Products

应用:
qPCR & RT-qPCR,
DNA Amplification, PCR & qPCR

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3030S     -20    
        Luna Cell Ready Lysis Buffer B8036AVIAL -20 2 x 1.4 ml 2 X
        Luna Cell Ready RNA Protection Reagent M0469AVIAL -20 1 x 0.25 ml 25 X
        Luna Cell Ready Protease M0473AVIAL -20 1 x 0.2 ml 25 X
        Luna Cell Ready Stop Solution B8037AVIAL -20 1 x 0.6 ml 10 X
       

      DNase I (RNase-free)

      		 M0474AVIAL -20 1 x 0.5 ml 10 X
        Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix M3002LVIAL -20 1 x 0.5 ml 20 X
        Luna® Universal One-Step Reaction Mix M3005SVIAL -20 5 x 1 ml 2 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 3 x 1.5 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 磷酸盐缓冲液（PBS）
    • 目标特异性引物
    • 细胞
    • Eppendorf 管，PCR 联管
    • PCR 板
    • qPCR 仪器
    • 移液器和移液枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Luna® Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit Protocol (NEB #E3030)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3030

  • 应用实例

    • High-throughput qPCR and RT-qPCR Workflows Enabled by Beckman Coulter Echo Acoustic Liquid Handling and NEB Luna Reagents

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What cell lines are compatible with the Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3030)?
    2. How many cells should I use for reliable detection?
    3. How many cells should I seed into cell culture plates to achieve optimal detection?
    4. Can cryopreserved cell lines or pelleted cells stored at -80°C be used with this kit? 
    5. How can lysis efficiency be determined?
    6. Why is it important to evaluate RNA damage or inhibition during cell lysis and one-step RT-qPCR detection?
    7. What is the “Luna Cell Ready RNA Protection Reagent” and when should it be used?
    8. Should I include a No-RT control reaction?
    9. Will the blue tracking dye interfere with detection?
    10. Is cell washing prior to lysis necessary?
    11. Which lysis format should I use?
    12. What protocol should be used for cell lysis? Can cells be lysed at room temperature or using a short protocol?
    13. When using cell lysates generated from Luna Cell Ready Lysis Module, can RT-qPCR experiments be set up at room temperature?
    14. How much cell lysate should I use as input? (NEB #3030)
    15. Can I use the cell lysates generated from the Luna Cell Ready Lysis Module for two-step RT-qPCR? 
    16. Why does the Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit contain more RT-qPCR reactions than lysis reactions?
    17. If either the Luna Cell Ready Lysis Module or Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit runs out, can I order them separately?
    18. How can I obtain more technical help related to Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit?