Luna® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒经过优化，适用于水解探针法的 SARS-CoV-2 实时 RT-PCR 检测。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而通过实时或定量 PCR（qPCR）实现 RNA 定量。探针法 qPCR/RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5′→3′ 核酸外切酶活性，将淬灭的靶标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量 PCR 每个循环中的 DNA 扩增。通过荧光信号显著超过背景荧光所经历的循环数，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。

图 1：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒组分

Luna® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒 |

图 2：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒可在一个反应中同时检测 N 基因两个区域和人源 RNase P 基因

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A. SARS-CoV-2 的两组引物/探针序列基于 CDC 提供的序列，其中探针改为两种荧光标记（N1：HEX，N2：FAM）。

B. RNase P 内标包含 Cy5 标记的探针和重新设计的反向引物。该引物的跨外显子设计，避免了人基因组 DNA（含有 2.4 kb 内含子）的扩增干扰。

SARS-CoV-2 引物/探针混合液包含 SARS-CoV-2 病毒中 N 基因两个区域的专用引物和探针 [基于美国疾控中心（CDC）提供的序列]。探针经修饰，包含不同的荧光团（N1：HEX；N2：FAM），可以在实时仪器的两个不同通道上同时进行观察。为了确保检测样品的完整性和无抑制物，还提供一套用于扩增人源 RNase P 基因的内标（IC）引物和探针。该靶基因的反向引物与 CDC 的设计不同，修改为跨外显子序列，以降低残留基因组 DNA 的扩增背景。IC 的扩增可在 Cy5 通道观测。产品同时还提供阳性对照（PC）模板（含有 SARS-CoV-2 N 基因的质粒）。

该试剂盒包含 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 混合液（含 UDG）（NEB #M3019），支持更大的上样量和混合样品池检测策略，对灵敏度和特异性的影响极小。该预混液包含一步法 RT-qPCR 的所有组分，以及独特的惰性参比染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。独具特色的是：预混液还包含防止交叉污染的热敏 UDG 和 dUTP，以及有助于观察反应体系建立的非荧光可见示踪染料。该示踪染料与 qPCR 常用荧光团的光谱没有重叠，因此不会干扰实时检测。

图 3：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限
比 TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix CG 更低

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将下述两种试剂盒进行检测下限（LOD）比较：使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对 2019-nCoV_N1 靶标（HEX）和 2019-nCoV_N2 靶标（FAM）进行多重 RT-qPCR 检测，实验设置参照 E3019 产品说明书中的反应和循环条件；使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG 对 2019-nCoV_ N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示：Luna 试剂盒对两个靶标的检测下限为 5 拷贝/反应，而 TaqPath 为 10 拷贝/反应。
图 4：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒适用于纯化 RNA 的混合样品池检测

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通过将一份 2 µl 的模拟阳性样品（10 拷贝的 Twist 合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA）与四份 2 µl 的模拟阴性样品（仅含 10 ng Jurkat 总 RNA）混合，制备出包含五份样品的混合样品池。将混合样品池（10 µl）与单独样品（2 µl，含 10 拷贝 N 基因和 10 ng Jurkat 总 RNA）进行性能比较。实验仪器为 Applied Biosystems 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。N1 和 N2 靶标的扩增曲线显示，单独和掺入混合样品池的阳性样品 Cq 值相似。由于混合样品池中人源总 RNA 量是单独样品的 5 倍，因此正如预期，混合样品池 RNase P 基因的 Cq 值更小。
图 5：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限（LOD）

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通过 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对多种 SARS-CoV-2 RNA 对照样品中的 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行多重 RT-qPCR 检测，获得该试剂盒的检测下限（LOD）。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中（图 A）。两位实验人员同时使用三种仪器进行平行测试（96 孔板，20 µl 反应体系）：Applied Biosystems（ABI）7500 Fast Real-Time instrument、ABI QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR system，以及 Bio-Rad CFX instrument。结果显示：Twist RNA 的检测下限均为 5 拷贝/反应。此外还测试了其它样品类型（图 B）：源自 ATCC 的 SARS-CoV-2 基因组 RNA（ATCC® VR-1986D™）、NIST（Fragment 1 – Includes SARS-CoV-2 sequence: 25949-29698 of isolate USA-WA1/2020），以及 SeraCare AccuPlex™ SARS-CoV-2 Verification Panel V2（0505-0132）。上述 RNA 均由 Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒（NEB# T2010）提取。所有 RNA 样品均掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA，使用 ABI 7500 Fast Real-Time instrument 检测。假设 RNA 提取的回收率为 100%，则各样品检测下限为：ATCC 的 SARS-CoV-2 基因组 RNA 为 2.5 GE（genomic copy equivalent，基因组拷贝当量）、NIST SARS-CoV-2 测试样品为 1×107 倍稀释、SeraCare AccuPlex 样品为 15 拷贝。
图 6：与 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG 相比，Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）对 SARS-CoV-2 N2 靶标的检测性能更好

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A.使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）对 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照 E3019 产品说明书中的反应和循环条件。
B.使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围扩增结果。实验仪器为 Applied Biosystems 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。在上述条件下，Luna 和 TaqPath 对 N1 靶标的扩增结果都很好。对于 N2 靶标，尽管 TaqPath 可检测 10 个拷贝样品，但线性度并不理想，而 Luna 线性度更好，且 Cq 的值出现更早。

在 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）中，联合使用 Taq 热启动 DNA 聚合酶与新型 WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，从而让在室温下建立体系更安全。经改造的 Luna WarmStart 反转录酶具备更高的热稳定性，最佳反应温度为 55℃。

图 7：Luna RT-qPCR 预混液的室温稳定性让实验流程更灵活

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使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液（含 UDG）对 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重（SP）和多重（MP）RT-qPCR 检测，实验设置参照 NEB #E3019 产品说明书中的反应和循环条件。使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围（100,000 – 10 拷贝）的扩增结果。上机前，将 RT-qPCR 反应分别在室温下温育 0、2、5、24 小时。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 μl 反应体系）。结果显示：Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液温育 0 至 24 小时的实验结果一致，而 TaqPath 温育 2 小时后，Cq 值延迟 ≥ 1，实验效果随温育时间的延长而下降。
 
产品类别:
Luna® qPCR & RT-qPCR Products,
PCR, qPCR & Amplification Technologies Products

应用:
qPCR & RT-qPCR

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3019S     -20    
        Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG M3019SVIAL -20 1 x 0.53 ml 4 X
        SARS-CoV-2 Positive Control (N gene) N2117SVIAL -20 1 x 0.05 ml Not Applicable
        SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X) S0631AVIAL -20 1 x 0.215 ml 10 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 1 x 1.5 ml Not Applicable
    • E3019L     -20    
        Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG M3019SVIAL -20 5 x 0.53 ml 4 X
        SARS-CoV-2 Positive Control (N gene) N2117SVIAL -20 1 x 0.05 ml Not Applicable
        SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X) S0631AAVIAL -20 1 x 1.06 ml 10 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 5 x 1.5 ml Not Applicable

  • 优势和特性

    Features

    • 支持高通量流程，包括 384 孔板测试模式（与低反应体系兼容）
    • 预混液包含的 UDG 和 dUTP 可防止交叉污染，减少污染风险
    • 经优化的引物/探针混合液可提高检测能力和灵敏度
    • 双重 WarmStart/热启动酶剂型为室温下建立反应体系及保持 24 小时的持久稳定打下基础
     

  • 相关产品

    相关产品

    • M3019 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG
    • N2117 SARS-CoV-2 Positive Control N gene

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Protocol (NEB #E3019)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3019

  • 应用实例

    • High-throughput qPCR and RT-qPCR Workflows Enabled by Beckman Coulter Echo Acoustic Liquid Handling and NEB Luna Reagents
    • The Luna 4X RT-qPCR Mix and Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit enable high throughput, automated detection workflows
    • Primer Monitor: an online tool to track SARS-CoV-2 variants that may impact primers used in diagnostic assays

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Do different SARS-CoV-2 variants impact the effectiveness of the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit?
    2. What components are included in the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit?
    3. How many test samples can be run on a 96-well plate?
    4. Does the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit enable carryover prevention/contamination reduction?
    5. Can I set up the SARS-CoV-2 assay at room temperature?
    6. How much sample can be added to the reaction as input for the SARS-CoV-2 assay?
    7. What targets do the SARS-CoV-2 Primer/Probe mix detect? How were these primers chosen?
    8. Is the sequence of the RNase P primer/probe set the same as the CDC?
    9. What is the SARS-CoV-2 Positive Control included in the kit?
    10. How are results interpreted in the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit?
    11. How stable is the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit primer mix?
    12. What types of samples/materials are compatible with the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit?
    13. What instruments are compatible with the Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit? 
    14. What are the sequences for the primers and probes included in the kit?
    15. Can I prepare a plate in advance?

质控、安全 & 法规

  • 质控分析

    每一新批次的 NEB 产品都要经过质控，以满足指定的质量标准，对特定产品的质量标准和每一批次的检测数据可以通过产品说明表格、COA、产品信息卡或者产品手册进行查阅或下载。关于 NEB 产品质控的详细信息，可从此处查阅。

  • 产品说明与变更通知

    产品说明表包含产品的储存温度、有效期和规格，这些文件的命名规则如下：[货号]_[规格]_[版本]

    • E3019S_L_v1
    • E3019S_L_v2

  • CoA 文件包含单个批次产品的储存温度、有效期和质控，这些文件的命名规则如下： [货号]_[规格]_[版本]_[Lot#]

    • E3019L_v1_10092225
    • E3019S_v1_10092230
    • E3019L_v1_10104995
    • E3019S_v1_10104994
    • E3019S_v1_10108769
    • E3019L_v1_10108770
    • E3019L_v1_10111841
    • E3019L_v1_10121084
    • E3019S_v1_10123078
    • E3019L_v1_10125551
    • E3019L_v1_10130846
    • E3019L_v1_10132125
    • E3019L_v1_10134716
    • E3019L_v1_10134875
    • E3019L_v1_10135262
    • E3019S_v1_10133078
    • E3019L_v1_10137486
    • E3019L_v1_10139525
    • E3019L_v1_10139570
    • E3019L_v1_10140882
    • E3019L_v1_10141276
    • E3019L_v1_10141412
    • E3019L_v1_10141865
    • E3019S_v1_10143642
    • E3019L_v1_10146113
    • E3019S_v1_10149316
    • E3019L_v1_10164055
    • E3019S_v1_10164056
    • E3019S_v1_10166257
    • E3019L_v2_10166258
    • E3019S_v2_10179736
    • E3019S_v2_10183729
    • E3019L_v2_10184734
    • E3019S_v2_10208161
    • E3019L_v2_10225979
    • E3019S_v2_10231235

  • SDS

    以下 SDS 文件可以帮助您安全地使用该产品

    • Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG
    • SARS-CoV-2 阳性对照（N 基因）
    • SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X)
    • Nuclease-free Water