模板置换反转录酶混合液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

模板置换反转录酶混合液中的反转录酶（RT）在其到达 RNA 模板的 5’末端后会添加几个非模板源的核苷酸。这几个非模板源的核苷酸可以与已知序列的模板置换寡核苷酸（TSO）退火，促使反转录酶从 RNA 模板上切换到 TSO 上。得到的 cDNA 含有 3’末端添加有已知序列（TSO 的互补序列）。该特征可用于多种下游应用，例如 cDNA 扩增、5’RACE（cDNA 末端快速扩增）和第二链 cDNA 合成。说明书中有优化的实验流程。
 

图 1：模板置换流程概览 

模板置换反转录酶混合液 |

当到达 RNA 模板的 5’端时，反转录酶会在 cDNA 的 3’端添加几个非模板源的核苷酸。这些非模板源的核苷酸可以与包含已知序列的模板置换引物退火,从而促使反转录酶从 RNA 模板上切换到 TSO 上。所得到的 cDNA 在 3′ 端包含一个通用序列（TSO 的互补序列）。
图 2：在单细胞 RNA-seq 实验中,模板置换反转录酶混合液相对于 Smart-seq2 方法的优势

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A.模板置换介导的 cDNA 扩增概述。反转录引物含有 5’接头，它与 TSO 一起在 cDNA 的 5’和 3’末端添加接头。之后可用识别接头序列的引物 PCR 扩增全部反转录产物。 

B-D.使用 NEB 模板置换反转录酶混合液或 Smart-seq2 方法(Picelli, S. et al.(2014). Nat. Protoc. 9, 171-81)，用 10 μg Universal Human Reference（UHR） RNA （Agilent）与 ERCC RNA Spike-In Mix I（Thermo Fisher Scientific）生成 cDNA 文库。然后使用 NEBNext® Ultra™ II FS DNA 文库制备试剂盒（NEB＃E7805）将每个 cDNA 文库制成 Illumina 文库，并在 Nextseq 500 上使用 2 x 75 个循环测序。将测序采样 2 x 1.2 M 个 reads（除非另有说明），去掉接头 reads，并且使用 Prinseq 过滤。B.显示的是样品总 reads（Total reads）、去掉接头的 reads（Trimmed reads）和通过 Prinseq 过滤的 reads（Filtered reads）。插图列举了每种方法制备的 cDNA 文库的 Agilent Bioanalyzer 2100 结果。虚线框标注了非特异片段。C.使用 Salmon 将过滤的 reads 与 GENCODE 28 和 ERCC 转录物比对。图中的点表示从每个文库检测到的 TPM（每百万转录数）≥1 的转录物的数量作为测序深度。 D.使用 Hisat 2.0.7 将过滤的读数与 hg19 人参考基因组比对，并使用 Picard SAM / BAM RNA Seq Metrics 工具计算 RNA-seq 指标。该图显示了分布于外显子（红色），rRNA（橙色），内含子（绿色），基因间区域（蓝色）的匹配 reads 和不匹配 reads（灰色）的百分比。 

图 3：模板置换反转录酶混合液在 5’RACE 的实验中操作简单,性能优异 

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A.模板置换介导的 5’RACE 概述。在模板置换反转录反应后，用反向基因特异性引物和正向 TSO 特异性引物进行 5’RACE PCR。 

B.使用 NEB 模板置换反转录酶混合液 5’RACE 方案（左）或 Clontech SMARTer 5’/3’RACE 试剂盒（右）对多种 RNA 靶标的 5’RACE 产物进行琼脂糖凝胶分析。加入 1 μg 的 Jurkat 总 RNA，10 pg 的 8 kb 合成 RNA 和 10 ng 的 ERCC RNA Mix 1，用于评估作为转录物长度和拷贝数的性能。在 NEB 的反应中，反转录引物为 oligo (dT)40 VN，TSO 为 GCTAATCATTGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG，TSO 中特异性 PCR 引物用下划线标注。两种方法使用相同的基因特异性 PCR 引物。靶标名称和预期片段长度如图所示。

图 4：模板置换反转录酶混合液在第二链 cDNA 合成中操作简单，且可捕获完整的 5’末端转录产物

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A.模板置换介导的第二链 cDNA 合成概述。在反转录反应后，RNA 模板水解，使用 TSO 作为引物延伸合成第二链 cDNA。 

B.使用 1 kb 的合成 RNA 作为模板，使用 poly（dT）40 VN 作为第一链 cDNA 合成的反转录引物。使用模板置换介导的方法或 Gubler 在文献中描述的方法—R and Hoffman,BJ.(1983) Gene,25,263-269，对第二链 cDNA 合成进行三个平行实验。所得到的双链 cDNA 产物使用反向引物用 Sanger 法对第二链 cDNA 进行测序。结果显示模板含有转录起始位点（TSS），并标注出了匹配序列。 添加到 cDNA 末端的 TSO 序列用灰色标注。未通过 Gubler 和 Hoffman 方法检测到的序列用蓝色标注。不可信读序区用黄色标注。 

产品类别:
cDNA Synthesis & Reverse Transcriptases Products,
PCR, qPCR & Amplification Technologies Products

应用:
cDNA Synthesis,
Reverse Transcription (cDNA Synthesis)

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0466S     -20    
        Template Switching RT Enzyme Mix  M0466SVIAL -20 1 x 0.02 ml 10 X
        Template Switching RT Buffer B0466SVIAL -20 1 x 0.5 ml 4 X
    • M0466L     -20    
        Template Switching RT Enzyme Mix  M0466LVIAL -20 1 x 0.1 ml 10 X
        Template Switching RT Buffer B0466SVIAL -20 1 x 0.5 ml 4 X

  • 特性和用法

    热失活

    80°C

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. cDNA Synthesis and Amplification Protocol using the Template Switching RT Enzyme Mix (NEB #M0466)
    2. 2nd Strand cDNA Synthesis Protocol using the Template Switching RT Enzyme Mix (NEB #M0466)
    3. 5′ RACE Protocol using the Template Switching RT Enzyme Mix (NEB #M0466)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Do I need to add RNase Inhibitor to the RT reaction when using the Template Switching RT Enzyme Mix?
    2. Numerous publications describe the addition of various additives (e.g., betaine and PEG) to improve template switching. Can I add any of those to my reaction?
    3. Is the Template Switching RT Enzyme Mix compatible with RT primers with degenerate bases for cDNA synthesis and amplification, as described in the mcSCRB method [1]? 
    4. What type of template switching oligos (TSOs) are compatible with the Template Switching RT Enzyme Mix?
       
    5. Can I use the Template Switching RT Enzyme Mix for regular RT reactions?
    6. What is the efficiency of template switching when using the Template Switching RT Enzyme Mix?
    7. Does the Template Switching RT Enzyme Mix work for prokaryotic RNA?
    8. Does the Template Switching RT Enzyme Mix work for fragmented RNA?
    9. What type of RT primers can be used with the Template Switching RT Enzyme Mix?
    10. Can I reduce the RT reaction time?