快速末端平齐化™ 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

快速末端平齐化试剂盒可将含有不匹配的 5´ 或 3´ 突出末端的 DNA 转变为带有 5´ 磷酸化平末端 DNA，以便有效地与平末端 DNA 克隆载体进行连接。用 T4 DNA 聚合酶（NEB #M0203）使 DNA 末端平齐化，该酶同时具有 3´→5´ 核酸外切酶活性和 5´→3´ 聚合酶活性。酶混合液中包含 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）（NEB #M0201），可将平末端 DNA 的 5´ 端磷酸化，以便后续与克隆载体进行连接。本试剂盒经过优化，可在单次反应中将 5 µg 的 DNA 末端平齐化。如需了解更多如何识别突出末端类型的信息，请观看此视频教程。

提供的末端平齐化酶混合液包含：100 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.1 mM EDTA、1 mM 二硫苏糖醇、0.1% Triton X-100 和 50% 甘油。

1X 末端平齐化缓冲液：
100 mM Tris-HCl
50 mM NaCl
10 mM MgCl2
0.025% Triton X-100
5 mM 二硫苏糖醇
25℃ 时 pH 为 7.5

产品类别:
DNA Manipulation Products

应用:
Blunting,
Phosphorylation (Kinase),
PCR,

Fast Cloning: Accelerate your cloning workflows with reagents from NEB

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1201S     -20    
        Blunting Enzyme Mix M1201AVIAL -20 1 x 0.025 ml Not Applicable
        10X Blunting Buffer B1201SVIAL -20 1 x 0.5 ml 10 X
        Deoxynucleotide Solution Mix (1 mM) N1201AVIAL -20 1 x 0.1 ml 1 mM
    • E1201L     -20    
        Blunting Enzyme Mix M1201AAVIAL -20 1 x 0.125 ml Not Applicable
        10X Blunting Buffer B1201SVIAL -20 1 x 0.5 ml 10 X
        Deoxynucleotide Solution Mix (1 mM) N1201AAVIAL -20 1 x 0.5 ml 1 mM

  • 优势和特性

    应用特性

    对剪切的、雾化的或经限制性内切酶消化的 DNA 进行末端平齐化，以便与质粒、cosmid、fosmid 和 BAC 载体进行连接

    PCR 产物在进行高效平末端克隆前预先末端平齐化

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    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 在进行末端平齐化之前，通过 PCR 扩增出的 DNA 必须采用 Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（NEB #T1030）等商用纯化试剂盒、苯酚抽提/乙醇沉淀或凝胶电泳的方法进行纯化。
    2. 限制性内切酶消化后的 DNA 无需纯化，可直接进行末端平齐化。末端平齐化酶混合液在末端平齐化缓冲液中可达到最佳活性，但在添加了 dNTP 和二硫苏糖醇的 NEBuffer 1、2、3、4 以及 BamHI、EcoRI 和 DpnII 专用缓冲液中同样具有活性。不过，这些缓冲液中的连接保真度略有降低。NEBuffer 1 的转化效率最低，总产量约为最佳产量的 50%。
    3. The Blunt Enzyme Mix has been optimized in Blunting Buffer, but is also active in NEBuffers 1,2,3 and 4, as well as BamHI, EcoRI and DpnII unique buffers when supplemented with dNTPs and dithiothreitol. There is a small reduction in ligation fidelity in these buffers. Transformation efficiency is lowest in NEBuffer 1 where the total yield is about 50% of optimum.
    4. 试剂盒中的 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）活性不需要 ATP。dNTP 混合液中的 dATP 和 dTTP 充当磷酸盐供体。
    5. 在进行磷酸酶处理之前，末端平齐化反应必须采用商用纯化试剂盒、苯酚抽提/乙醇沉淀或凝胶电泳的方法进行纯化。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for the Quick Blunting Kit (E1201)
    2. Transformation Protocol
    3. Quick Ligation Protocol (M2200)

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Blunting Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBcloner®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Which ligase is recommended to ligate DNA treated with the Quick Blunting Kit?
    2. Can I use regular ligase to ligate my blunted product?
    3. I’ve blunted my DNA and now need to dephosphorylate the reaction with Antarctic Phosphatase. Do I need to purify the reaction?
    4. Does the PCR product need to be purified before blunting with the Quick Blunting Kit? What methods can be used to purify the product?
    5. I’ve digested my DNA and now want to blunt directly without purifying, can I add the blunting reagents directly to the restriction digest?
    6. I’ve blunted my sonicated gDNA for 15 minutes instead of the recommended 30 minute incubation time, will the reaction still work?
    7. I’ve accidentally skipped the heat-kill step after the blunting reaction. Will the ligation still work?

  • 问题解决指南

    • EpiMark® Methylated DNA Enrichment Kit Troubleshooting Guide