LpnPI |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

LpnPI 已经过 EpiMark® 验证，是一种修饰依赖的内切酶，可以识别 CmCDG 位点并在修饰化胞嘧啶的 3´ 端 N10/N14 处切割双链 DNA。识别位点的胞嘧啶修饰包括 C5-甲基化（5-mC）和 C5-羟甲基化（5-hmC）（1）。

本酶配有酶激活溶液，可用于辅助 LpnPI 高效酶切。

在真核生物中最常见的表观遗传学修饰为 CpG 或 CHG 位点处的甲基化标记。这些修饰位点中有一部分可被 LpnPI 识别并酶切。

在完全甲基化的 CpG 位点处：
5´ . . . C mC  G G . . . 3´
3´ . . . G G mC C . . . 5´

或 CHG 位点：
5´ . . . CmC D  G G . . . 3´
3´ . . . G G H mC C . . . 5´

H = A 或 C 或 T（非 G）
D = A 或 G 或 T（非 G）

LpnPI 单独识别每个半甲基化位点，并进行双向酶切，产生 32 碱基或 31 碱基的片段。这些片段包含中间的甲基化位点，并在各个末端含有 4 碱基 5´ 突出末端。LpnPI 不会酶切未经修饰的 DNA。

产品来源

大肠杆菌菌株，携有克隆自嗜肺军团菌属（Legionella pneumophila）Philadelphia 1 的 LpnPI 基因。

产品类别:
Discontinued (<3 years)

  • 特性和用法

    单位定义

    一个单位是指在 50 µl 的总反应体系中，37°C 下，1 小时内酶切 1 µg pBR322（dcm+）DNA 所需的酶量。

    反应条件

    1X rCutSmart™ 缓冲液
    Supplement with 1X 酶活化剂溶液
    Incubate at 37°C

    1X rCutSmart™ 缓冲液
    50 mM Potassium Acetate
    20 mM Tris-acetate
    10 mM Magnesium Acetate
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    使用浓度

    4,000 units/ml

    在不同缓冲液中的活性

    NEBuffer™ r1.1: <10%
    NEBuffer™ r2.1: <10%
    NEBuffer™ r3.1: <10%
    rCutSmart™ Buffer: 100%

    稀释兼容性

    • 稀释液 B

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    300 mM NaCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    500 µg/ml BSA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 20 minutes

    甲基化敏感性

    dam 甲基化: 不敏感
    dcm 甲基化: 不敏感
    CpG甲基化: 不敏感

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    单独销售的组分

    • rCutSmart™ 缓冲液

  • 注意事项

    1. 此酶用于表观遗传学分析，底物 DNA 的两条链中均包含 CpG 甲基化位点，被 LpnPI 酶切后产生包含 CpG 甲基化位点的 32 bp 片段。对分离得到的 32 bp 片段进行测序可发现 5-mC 修饰位点（Cohen-Karni et al.,（2011）PNAS 108: 11040-11045）。
    2. 过量使用酶会抑制酶切。您需要优化每种底物 DNA 进行完全酶切所需的酶量。
    3. 延时酶切、高酶浓度或活化剂或甘油浓度 > 5% 等非理想的反应条件下可能出现星号活性，包括非甲基化 DNA 底物的酶切。每种底物 DNA 可能都需要优化酶量以实现高效的特异性切割，同时避免星号活性。
    4. 可通过以下方式实现 5-mC 位点的最佳特异性酶切：在 1X 酶激活溶液中，将 LpnPI 与 5-mC 识别位点的摩尔比介于 0.1:1 到 1:1 之间，酶切时间不超过 60 分钟。（LpnPI 的摩尔浓度约为 2.9 μM）。
    5. 对 CpG、dcm 或 dam 甲基化均不敏感。
    6. 延长酶切时间、高浓度酶或 >5% 的甘油浓度可能产生星号活性

  • 参考文献

    1. Zheng, Y. et al. (2010). Nucl. Acids Res. doi:10, 1093/nar/gkq327.
    2. U.S. Publication No. 2010-0167942 Unpublished observation
    3. Cohen-Karni D et al. (2010). The MspJI family of modification dependent restriction endonucleases for epigenetic studies.. Proc. Natl Acad Sci U.S.A.. Jul 5;108(27), 11040-5.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Restriction Digest Protocol
    2. Protocol for generating 32 bp fragments from modified CpG sites in genomic DNA using MspJI, FspEI or LpnPI

  • 使用指南

    • Activity at 37°C for Restriction Enzymes with Alternate Incubation Temperatures
    • Activity of Restriction Enzymes in PCR Buffers
    • Cleavage Close to the End of DNA Fragments
    • Digestion of Agarose-Embedded DNA: Info for Specific Enzymes
    • Double Digests
    • Heat Inactivation
    • NEBuffer Activity/Performance Chart with Restriction Enzymes
    • Optimizing Restriction Endonuclease Reactions
    • Restriction Endonucleases – Survival in a Reaction
    • Restriction Enzyme Diluent Buffer Compatibility
    • Restriction Enzyme Tips
    • Single Letter Codes
    • Star Activity
    • Traditional Cloning Quick Guide

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Alphabetized List of Recognition Sequences
    • Compatible Cohesive Ends and Generation of New Restriction Sites
    • Dam-Dcm and CpG Methylation
    • Enzymes with Multiple Recognition Sequences
    • Enzymes with Nonpalindromic Sequences
    • Frequencies of Restriction Sites
    • Isoelectric Points (pI) for Restriction Enzymes
    • Isoschizomers
    • NEB Diluent and Buffer Table
    • Restriction Enzymes for Epigenetics Selection Chart
    • Why Choose Recombinant Enzymes?

  • Web 工具

    • Competitor Cross-Reference Tool
    • DNA Sequences and Maps Tool
    • Double Digest Finder
    • Enzyme Finder
    • NEBcutter™ v3.0
    • NEBioCalculator®
    • REBASE®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How has LpnPI been used for epigenetic studies?
    2. How can I minimize off target or star activity?
    3. Should I add more LpnPI to get more cutting?
    4. Is this enzyme sensitive to dam, dcm or mammalian CpG methylation?
    5. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?

  • 问题解决指南

    • Restriction Enzyme Troubleshooting Guide